Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Summary

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Abstract

Hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin), kendi kendini yenileme ve bireyin ömrü boyunca kan soyların bütün hücre tipleri oluşturmak yeteneğine sahip. Tüm HKH'lerin kendi havuzu boyutu kendini sürekli yenileyen hücre bölünmeleri tarafından yapılmaktadır, bundan sonra, embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkar. HSC gelişme sürecini düzenleyen HKH'lerin ve kritik gelişimsel olayların anatomik kökenli belirlenmesi, birçok anatomik siteler fetal hematopoez sırasında katılmak olarak karmaşık olmuştur. Son zamanlarda, büyük hematopoetik bir organ olarak HKH'lerin (Gekas, ve ark 2005, Rodos, ve ark 2008) ve eşsiz microenvironmental nişler genişletilmiş plasenta belirledi. Sonuç olarak, plasenta, bunların ortaya çıkması ve ilk genişleme sırasında HKH'lerin önemli bir kaynak.

Bu makalede, biz E10.5 ve sırasıyla HKH'lerin başlatılması ve plasenta HSC havuzu boyutu zirve gelişim evreleri ile ilgili E12.5 embriyolar, fare plasentanın izolasyonu için diseksiyon teknikleri gösteriyor. Buna ek olarak, flow sitometri veya fonksiyonel testleri kullanmak için tek hücre süspansiyonu içine plasental doku enzimatik ve mekanik ayrılma için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Plasentanın tek hücre süspansiyonu için kollajenaz kullanımı HKH'lerin yeterli verimi verdiğini bulduk. Plasenta HSC verimi etkileyen önemli bir faktör, önceden mekanik ayrılma derecesi, ve enzimatik tedavi süresi.

Biz de onların hassas hücresel nişler içinde immünohistokimya HKH'lerin gelişmekte olan görselleştirme için sabit-dondurulmuş plasental doku kesitlerinde hazırlanması için bir protokol sağlar. Hematopoetik spesifik antijenler parafin bölümlerinin hazırlanması sırasında korunur olarak, rutin plasental HKH'lerin ve atalarıdır lokalize için sabit dondurulmuş bölümleri kullanabilirsiniz.

Protocol

1. Embriyo kaldırma ve plasental diseksiyonu Başlamak için, embriyolarının ilk hamile barajlardan izole edilmelidir. Hayvanlar onaylanmış prosedürlere göre ötenazi bizim durumumuzda ölümcül dozda anestezi izofluran kullanmak için gidiyoruz İlk olarak, etanol ile karın sprey ve bir makas ile küçük bir kesi yapmak. Karın ortaya çıkarmak ve periton açık kesmek için iki elinizle deri koparmak. Forseps ile uterin boynuz pick up ve onları her distal s…

Discussion

Bu protokol açıklanan deneysel prosedürleri plasental doku ve hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin izolasyonu ve görüntüleme için izin verir. Fetal gelişim boyunca plasenta ve diğer fetal hematopoetik organlar HKH'lerin beklenen hücresel verim ve sayısı hakkında kapsamlı bir özeti için Gekas, ark bakın. 2005. Plasenta gelişmekte HKH'lerin ve diğer hematopoetik hücreler lokalizasyonu için Rodos ve ark bakın. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)