Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus
Summary
Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.
Abstract
Depuis son développement en Sakmann et Neher 1, 2, le patch-clamp s'est imposé comme une technique extrêmement utile pour la mesure électrophysiologique des canaux ioniques uniques ou multiples dans les cellules. Cette technique peut être appliquée aux canaux ioniques, tant dans leur environnement natif et exprimé dans des cellules hétérologues, tels que des ovocytes récoltés à partir de la grenouille africaine griffes, Xenopus laevis. Ici, nous décrivons la technique bien établie de l'enregistrement de patch-clamp à partir d'ovocytes de Xénope. Cette technique est utilisée pour mesurer les propriétés des canaux ioniques exprimés soit au sein des populations (macropatch) ou individuellement (un seul canal d'enregistrement). Nous nous concentrons sur les techniques pour maximiser la qualité de la préparation des ovocytes et la génération de phoque. Avec tous les facteurs optimisée, cette technique donne une probabilité de succès au cours de génération d'étanchéité 90 pour cent. Le processus peut être optimisé différemment par chaque chercheur sur la base des facteurs qu'il ou elle trouve le plus important, et nous présentons la démarche qui ont conduit à la plus grande réussite dans nos mains.
Protocol
Discussion
Il ya de nombreux paramètres d'enregistrement électrophysiologiques pas discuté ici. Configuration Rig, la gestion du bruit du système, l'expression de canaux, et des protocoles d'enregistrement sont tous également critique pour de bons résultats expérimentaux.
Dans notre expérience, ce sont les paramètres les plus critiques pour la formation de joints d'étanchéité fiable: ovocytes de grande qualité, en enlevant la membrane vitelline rapidement (aka, «peeling»), utiliser des pipettes nouvellement tiré…
Acknowledgements
Recette de solution de rétrécissement est du laboratoire de RW Aldrich. Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l'American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
