Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert
Summary
Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.
Abstract
Seit der Entwicklung von Sakmann und Neher 1, 2, hat der Patch-Clamp zu einem etablierten und äußerst nützliche Technik für elektrophysiologische Messung von einzelnen oder mehreren Ionenkanälen in Zellen. Diese Technik kann auf Ionenkanäle sowohl in ihrer natürlichen Umgebung angewendet werden und ausgedrückt in heterologen Zellen, wie Eizellen aus dem Krallenfrosch, Xenopus laevis geerntet. Hier beschreiben wir die gut etablierte Technik der Patch-Clamp-Aufzeichnung von Xenopus Oozyten. Diese Technik wird verwendet, um die Eigenschaften ausgedrückt Ionenkanäle entweder messen in der Bevölkerung (macropatch) oder einzeln (Single-Channel-Aufnahme). Wir konzentrieren uns auf Techniken konzentrieren, die Qualität der Eizelle Vorbereitung und Dichtung Generation zu maximieren. Bei allen Faktoren optimiert, bietet diese Technik eine Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Abdichtung Generation über 90 Prozent. Der Prozess kann unterschiedlich von jedem Forscher auf die Faktoren, er oder sie findet wichtigste Basis optimiert werden, und wir stellen den Ansatz, die zu den größten Erfolg in unseren Händen haben.
Protocol
Discussion
Es gibt viele Parameter elektrophysiologische Ableitung hier nicht diskutiert. Rig Setup, sind System-Management-Lärm-, Kanal-Ausdruck, und die Aufnahme Protokolle allem auch entscheidend für die gute experimentelle Ergebnisse.
Nach unserer Erfahrung sind die wichtigsten Parameter für die Bildung zuverlässige Dichtungen: hochwertige Eizellen, die Beseitigung der Dotterhaut schnell (auch bekannt als "Peeling"), verwenden Sie neu gezogen Pipetten vor Staub geschützt, glatte Pipetten, positive Druck beim Betreten des Bad…
Acknowledgements
Schrumpfende Lösung Rezept stammt aus dem Labor von RW Aldrich. Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
