Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.
Abstract
Sakmann ve Neher 1, 2, geliştirme bu yana, yama kelepçe hücreleri tekli veya çoklu iyon kanallarının elektrofizyolojik ölçüm için son derece yararlı bir teknik olarak kurulan haline gelmiştir . Bu teknik, kendi doğal ortamında hem de iyon kanalları için uygulanabilir ve heterolog hücreleri, Afrika pençeli kurbağası, Xenopus laevis hasat oosit gibi ifade edilebilir. Burada, Xenopus oositleri yama kelepçe kayıt köklü bir tekniktir açıklar. Bu teknik, bireysel olarak nüfus (macropatch) ya da (tek kanallı kayıt) olarak ifade iyon kanalları özelliklerini ölçmek için kullanılır. Oosit hazırlanması ve conta üretimi kalitesini en üst düzeye çıkarmak için teknikleri üzerine odaklanır. Tüm faktörleri optimize edilmiş, bu tekniğin başarılı conta üretimi yüzde 90 üzerinde bir olasılık verir. Bu süreç, o en önemli buluntu faktörlere dayanan her araştırmacı tarafından farklı olarak optimize edilmiş, ve biz elimizde en büyük başarısı için yol var yaklaşım mevcut olabilir.
Protocol
Bölüm 1: vitellin membran Çıkarma Forseps iki set hazırlayın. Biz bir takım hafif bir dosya ile bilenmiş olmuştur No: 5 forseps tercih ediyor. Ayrıca 7 "Pasteur pipeti kırparak ve yangın parlatma, bir cam transferi pipet hazırlar. Önerilen: oosit kaymasını önlemek için, ızgara bir daire (1 mm kareler) kesme ve 60mm bir Petri kabı altına yapıştırıcı. Bu yemek, kullanımlar arasında temiz tutulması halinde süresiz olarak yeniden kullanılabilir. Bir …
Discussion
Burada tartışılan elektrofizyolojik kayıt birçok parametre vardır. Rig kurulum, sistem gürültü yönetimi, kanal ifadesi, ve kayıt protokolleri iyi deneysel sonuçlar da kritik öneme sahiptir.
Deneyimlerimize göre, bu güvenilir mühürler oluşturan en önemli parametreler şunlardır: banyo girerken yüksek kalitede oosit, (nam-ı diğer "soyma") hızla vitellin membran kaldırarak, tozdan korunan yeni çekilmiş pipetler, pürüzsüz pipetler, uygulanan pozitif basınç çözümü, kapatılmadan önce banyoda…
Acknowledgements
Daraltma çözüm tarifi RW Aldrich laboratuar. Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı, Amerikan Kalp Derneği, Müsküler Distrofi Derneği, Donald B. ve Delia E. Baxter Vakfı, Klingenstein Fonu ve McKnight Endowment for Neuroscience için: Biz aşağıdaki finansman kuruluşları ve vakıflar destek için teşekkür ederiz.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).