הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus
Summary
זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.
Abstract
מאז הפיתוח שלה על ידי Sakmann ואת נהר 1, 2, מהדק את התיקון הפך הוקמה טכניקה שימושית מאוד עבור מדידה אלקטרו של תעלות יונים יחיד או מספר תאים. טכניקה זו ניתן להחיל על תעלות יונים בסביבה הן מולדתם והביעו בתאים Heterologous, כגון ביציות שנקטפו מן הצפרדע טפרים אפריקה, Xenopus laevis. כאן אנו מתארים את הטכניקה מבוססת היטב של הקלטה תיקון מהדק מ ביציות Xenopus. טכניקה זו משמשת כדי למדוד את המאפיינים של תעלות יונים לידי ביטוי גם באוכלוסיות (macropatch) או בנפרד (יחיד ערוץ הקלטה). אנו מתמקדים וטכניקות על מנת למקסם את איכות הביצית הכנה הדור חותם. עם כל הגורמים אופטימיזציה, טכניקה זו נותנת הסתברות של הדור חותם מוצלח מעל 90 אחוז. התהליך עשוי להיות מותאם באופן שונה על ידי כל חוקר מבוסס על הגורמים הוא או היא מוצאת החשוב ביותר, ואנחנו מציגים את הגישה כי יש להוביל להצלחה רבה בידינו.
Protocol
Discussion
ישנם פרמטרים רבים הקלטה אלקטרו לא נדון כאן. התקנת המתקן, רעש מערכת ניהול, הביטוי הערוץ, ופרוטוקולים הקלטה דבר קריטי גם תוצאות הניסוי טוב.
מניסיוננו, אלו הם הפרמטרים הקריטיים ביותר עבור יצירת חותמות אמין: ביציות באיכות גבוהה, הסרת קרום vitelline מהר (aka, "פי?…
Acknowledgements
מתכון הפתרון הוא כיווץ מהמעבדה של RW אולדריץ'. אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב 'דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק' נייט למדעי המוח.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
