Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen
Summary
Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie van<em> Xenopus laevis</em> Eicellen met een nucleair import substraat, alsmede de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden elektronenmicroscopie.
Abstract
Micro-injectie van de Xenopus laevis oöcyten gevolgd door een dunne-snijden elektronenmicroscopie (EM) is een uitstekend systeem voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Door zijn grote kern en een hoge dichtheid van de nucleaire porie complexen (NPC), kan nucleair transport gemakkelijk gevisualiseerd in het Xenopus eicel. Veel inzicht in de mechanismen van de nucleaire import en export is opgedaan door het gebruik van dit systeem (beoordeeld door Pante, 2006). Daarnaast hebben we gebruik gemaakt van micro-injectie Xenopus oöcyten om de nucleaire import paden van verschillende virussen die zich vermenigvuldigen in de gastheer kern ontleden.
Hier laten we zien de cytoplasmatische micro-injectie van Xenopus oöcyten met een nucleair import substraat. We tonen ook de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden EM, zoals dissectie, uitdroging, en inbedding van de eicellen in een epoxy hars inbedding. Tot slot bieden wij representatieve resultaten voor eicellen die zijn gemicroinjecteerd met het capside van het baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) of het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), en bespreken mogelijke toepassingen van de techniek.
Protocol
Discussion
Micro-injectie van Xenopus oöcyten in combinatie met thin-coupes EM is een zeer effectief middel voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Dit systeem is gebruikt om verschillende stappen van de invoer kaart door middel van de NPC, bijvoorbeeld interactie van een nucleaire import substraat met structurele componenten van het NPC, zoals de cytoplasmatische filamenten en de nucleaire basket (beoordeeld door Pante, 2006). Het is ook gebruikt om de nucleaire import van nucleair-replicerende virussen (Pa…
Acknowledgements
Wij bedanken David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) voor het verstrekken van de baculovirus AcMNPV en voor nuttige discussie.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canada Foundation for Innovation (CFI), de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR), en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) .
Riferimenti
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).
- Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).
- Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).
- Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
