Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis

Summary

Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de la<em> Xenopus laevis</em> Ovocytes avec un substrat import nucléaire, ainsi que la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par microscopie électronique mince sectionnement.

Abstract

Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis suivie mince sectionnement microscopie électronique (EM) est un excellent système pour étudier le transport nucléocytoplasmique. En raison de son gros noyau et une forte densité de complexes des pores nucléaires (NPC), transport de matières nucléaires peuvent être facilement visualisés dans l'ovocyte de Xénope. Beaucoup de perspicacité dans les mécanismes de l'importation et l'exportation nucléaire a été acquise grâce à l'utilisation de ce système (revu par Pantè, 2006). En outre, nous avons utilisé la microinjection d'ovocytes de Xenopus pour disséquer les voies import nucléaire de plusieurs virus qui se répliquent dans le noyau hôte.

Ici nous démontrer la micro-injection cytoplasmique des ovocytes de Xenopus avec un substrat import nucléaire. Nous montrons aussi la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par de minces coupes-EM, y compris la dissection, la déshydratation, et l'inclusion des ovocytes dans une résine époxy intégration. Enfin, nous fournissons des résultats représentatifs pour les ovocytes qui ont été micro-injecté avec la capside du nucléopolyhédrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) ou le virus minute parvovirus de la souris (MVM), et de discuter des applications potentielles de cette technique.

Protocol

Partie 1: Préparation des ovocytes de Xenopus pour la microinjection Placer un petit morceau (environ 2 cm) de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de solution de collagénase (5 mg / ml de collagénase en calcium sans modification Barth salin: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mm MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). La collagénase est utilisée pour enlever les cellules folliculaires qui entourent l'ovocyte. Placer le tube sur une plateforme…

Discussion

Microinjection d'ovocytes de Xenopus combinée avec de fines coupes-EM est un outil très efficace pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Ce système a été utilisé pour cartographier les étapes distinctes de l'importation par le NPC, d'interaction exemple d'un substrat import nucléaire avec des composants structurels de l'APN, comme les filaments cytoplasmiques et nucléaires panier (revu par Pantè, 2006). Il a également été utilisée pour étudier l'import nucléaire …