פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של<em> תסיסנית melanogaster</em> העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה 1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) – חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS 2.
העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם 3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות 4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.
פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מ?…
פרוטוקול זה משמש כיום במעבדה שלנו שוכללה במרוצת השנים על ידי אנשים רבים, כולל בני הזוג דוד שארפ, Mijung קוון, פטריציה Sommi, Dhanya Cheerambathur. אנו מודים ד"ר ביל סאליבן (UCSC), אשר סיפק לנו עצה מצוינת על מניפולציה ו microinjection מוקדם של עוברים תסיסנית כאשר עבודתנו במערכת זו היה להיות יזם (ref. 13). אנו מודים לכל חברי המעבדה Scholey. העבודה שלנו על מיטוזה ב תסיסנית נתמך על ידי NIH מענק GM55507.