Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של<em> תסיסנית melanogaster</em> העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה 1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) – חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS 2.
העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם 3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות 4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מ?…
Acknowledgements
פרוטוקול זה משמש כיום במעבדה שלנו שוכללה במרוצת השנים על ידי אנשים רבים, כולל בני הזוג דוד שארפ, Mijung קוון, פטריציה Sommi, Dhanya Cheerambathur. אנו מודים ד"ר ביל סאליבן (UCSC), אשר סיפק לנו עצה מצוינת על מניפולציה ו microinjection מוקדם של עוברים תסיסנית כאשר עבודתנו במערכת זו היה להיות יזם (ref. 13). אנו מודים לכל חברי המעבדה Scholey. העבודה שלנו על מיטוזה ב תסיסנית נתמך על ידי NIH מענק GM55507.
Riferimenti
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
