Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial
Summary
Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el<em> Drosophila melanogaster</em> Embrión sincitial para estudiar mitosis.
Abstract
Este protocolo describe el uso del embrión de Drosophila melanogaster sincitial para el estudio de la mitosis 1. Drosophila tiene una genética útil con un genoma secuenciado, y puede ser fácil de mantener y manipular. Muchos mutantes de mitosis existen, y las moscas transgénicas que expresan funcionales fluorescente (GFP, por ejemplo) – etiquetado proteínas mitótico han estado y están generando. Expresión de genes diana es posible utilizar el sistema GAL4/UAS 2.
El embrión de Drosophila temprana lleva a cabo múltiples mitosis muy rápidamente (la duración del ciclo celular, ≈ 10 min). Es muy adecuado para obtener imágenes de la mitosis, ya que durante los ciclos de 10-13, los núcleos se dividen rápidamente y de forma sincrónica sin intervenir citocinesis en la superficie del embrión en una sola monocapa justo debajo de la corteza cerebral. Estos núcleos se dividen rápidamente, probablemente el uso de la maquinaria mitótica igual que otras células, pero que están optimizados para la velocidad, el puesto de control general, se cree que no se estrictas, lo que permite el estudio de las proteínas mitótico cuya ausencia podría causar detención del ciclo celular en células con un control fuerte . Los embriones que expresan proteínas GFP etiquetados o microinyección con la etiqueta fluorescente proteínas pueden ser fácilmente imágenes para seguir la dinámica de vida (Fig. 1). Además, los embriones pueden ser microinyección con el bloqueo de la función-anticuerpos o inhibidores de proteínas específicas para estudiar el efecto de la pérdida o la perturbación de su función 3. Estos reactivos se difunden en todo el embrión, llegando a muchos ejes para producir un gradiente de concentración del inhibidor, lo que a su vez se traduce en un gradiente de defectos comparable a una serie de alelos de mutantes. Idealmente, si la proteína diana es marcado con fluorescencia, el gradiente de inhibición se puede visualizar directamente 4. Se supone que el más fuerte fenotipo es comparable con el fenotipo nulo, a pesar de que es difícil excluir formalmente la posibilidad de que los anticuerpos pueden tener efectos dominantes en raras ocasiones, los controles tan rigurosos y una prudente interpretación debe ser aplicada. Más lejos del sitio de la inyección, la función de proteínas es sólo parcialmente perdido permitir otras funciones de la proteína diana a hacerse evidente.
Protocol
Discussion
Este protocolo es relativamente sencillo, sin embargo, cada paso requiere de práctica para asegurarse de que los embriones no están dañados. Cuidadosos experimentos de control siempre se necesita hacer para asegurar que los resultados se están obteniendo fiables. Una buena manera de comenzar es mediante la microinyección de tubulina buffer o rodamina en embriones de control que expresan GFP-tubulina para asegurarse de que la mitosis procede normalmente a través de todos los ciclos en la superficie del embrión (ci…
Acknowledgements
Este protocolo se utiliza actualmente en nuestro laboratorio y ha sido perfeccionado a lo largo de los años por muchas personas como los doctores David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur Dhanya. Se agradece al Dr. Bill Sullivan (UCSC), que nos ha proporcionado excelentes consejos sobre la manipulación y la microinyección de los primeros embriones de Drosophila, cuando nuestro trabajo en este sistema se está iniciando (ref. 13). Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Scholey. Nuestro trabajo en la mitosis en Drosophila es apoyado por el NIH subvención GM55507.
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