Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial
Summary
Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução na<em> Drosophila melanogaster</em> Sincicial embrião para estudar a mitose.
Abstract
Este protocolo descreve o uso do embrião Drosophila melanogaster sincicial para estudar a mitose 1. Drosophila tem uma genética útil com um genoma sequenciado, e pode ser facilmente mantido e manipulado. Mutantes mitose existem muitas, e as moscas transgênicas expressando funcional fluorescente (GFP, por exemplo) – proteínas mitótica tagged foram e estão sendo gerados. Expressão do gene alvo é possível utilizar o sistema GAL4/UAS 2.
O embrião Drosophila cedo realiza múltiplas mitoses muito rapidamente (duração do ciclo celular, ≈ 10 min). É bem adequado para imagens de mitose, pois durante os ciclos de 10-13, os núcleos se dividem rapidamente e de forma síncrona sem intervir citocinese na superfície do embrião em uma monocamada única logo abaixo do córtex. Esses núcleos se dividem rapidamente, provavelmente, usar o aparelho mitótico mesmo que outras células, mas eles são otimizados para a velocidade, o ponto de verificação é acreditado geralmente para não ser rigoroso, permitindo o estudo de proteínas mitótica cuja ausência poderia causar parada do ciclo celular em células com um posto de controle forte . Embriões que expressam proteínas GFP rotulados quanto com microinjeção de proteínas fluorescentes rotulados podem ser facilmente visualizados para acompanhar a dinâmica ao vivo (Fig. 1). Além disso, os embriões podem ser microinjeção com função de bloqueio de anticorpos ou inibidores de proteínas específicas para estudar o efeito da perda ou perturbação da sua função 3. Estes reagentes podem se propagar por todo o embrião, atingindo muitos fusos para produzir um gradiente de concentração de inibidor, o que resulta em um gradiente de defeitos comparável a uma série alélica de mutantes. Idealmente, se a proteína-alvo é fluorescente etiquetado, o gradiente de inibição pode ser diretamente visualizada 4. Supõe-se que o mais forte fenótipo é comparável ao fenótipo nulo, embora seja difícil formalmente excluir a possibilidade de que os anticorpos podem ter efeitos dominante em casos raros, os controles de modo rigoroso e interpretação cautelosa deve ser aplicado. Mais longe do local da injeção, a função da proteína é apenas parcialmente perdido permitindo que outras funções da proteína-alvo para se tornar evidente.
Protocol
Discussion
Este protocolo é relativamente simples, no entanto, cada etapa requer prática para se certificar de que os embriões não estão danificados. Experimentos de controle cuidadoso sempre precisa ser feito para garantir que os resultados estão sendo obtidos confiável. Uma boa maneira de começar isso é microinjecting tubulina buffer ou rodamina em embriões de controle expressando GFP-tubulina para se certificar de que a mitose prossegue normalmente através de todos os ciclos na superfície do embrião (ciclos de 10 a…
Acknowledgements
Este protocolo é usado atualmente em nosso laboratório e tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos por muitas pessoas, incluindo os Drs. David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur dhanya. Agradecemos a Dr Bill Sullivan (UCSC), que nos forneceu excelentes conselhos sobre a manipulação e microinjeção de embriões Drosophila quando o nosso trabalho neste sistema estava sendo iniciada (ref. 13). Agradecemos a todos os membros do laboratório Scholey. Nosso trabalho sobre mitose em Drosophila é suportado pelo NIH conceder GM55507.
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