Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo
Summary
Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı açıklanır<em> Drosophila melanogaster</em> Sinsityal embriyo mitoz çalışma.
Abstract
Bu protokol, Drosophila melanogaster sinsityal embriyo mitoz 1 eğitim için kullanımı anlatılmaktadır. Drosophila sıralı genomu ile yararlı genetik ve kolayca korunur ve manipüle edilebilir. Birçok mitotik mutantlar var ve (örneğin, GFP) floresan fonksiyonel ifade transgenik sinekler etiketli mitotik proteinler edilmiş ve üretildikten sonra. Hedeflenen gen ekspresyonu GAL4/UAS sistemi 2 ile mümkündür.
Drosophila erken embriyo (hücre döngüsü süresi, ≈ 10 dk), birden mitoz çok hızlı bir şekilde yürütmektedir . Döngüleri 10-13 sırasında, çekirdeklerin, korteks hemen altında tek tek tabakalı embriyonun yüzeyindeki sitokinez müdahale olmadan hızlı bir şekilde ve eşzamanlı olarak bölmek, çünkü iyi görüntüleme mitoz için uygundur. Bu hızla bölünerek çekirdekleri, muhtemelen, diğer hücrelerin aynı mitotik makine kullanımı, ancak hız için optimize edilmiş, kontrol noktasında genellikle yokluğu güçlü bir kontrol noktasında hücreler hücre siklusu durmasına neden olur mitotik proteinlerin çalışma izin sıkı olmamalıdır inanılmaktadır . Veya GFP etiketli proteinlerin ifade Embriyolar floresan ile işaretlenmiş proteinler microinjected canlı dinamikleri takip etmek (Şekil 1) kolayca görüntülü olabilir. Buna ek olarak, embriyoların 3, işlev kaybı veya pertürbasyon etkisini araştırmak için spesifik proteinlerin fonksiyonu bloke edici antikorlar veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. Bu reaktifler inhibitör konsantrasyonunun bir degrade, mutant alel serisi ile karşılaştırılabilir kusurları bir degrade dönüş sonuçlar üretmek için birçok iğ ulaşan embriyo boyunca diffüz İdeal olarak, hedef proteinin floresan etiketli ise inhibisyon degrade 4 direkt görüntülenebilmekte olabilir. Resmen antikorlar uygulanması gereken nadir durumlarda, bu kadar sıkı kontrol ve ihtiyatlı yorumu baskın etkileri olabileceği olasılığını dışlamak için zor olsa da, güçlü fenotip boş fenotip karşılaştırılabilir olduğu varsayılır. Enjeksiyon yerinden daha uzak, protein fonksiyonu sadece kısmen hedef proteinin diğer işlevler belirgin hale izin kaybetti.
Protocol
Discussion
Bu protokol, ancak her adım embriyoların zarar görmediğinden emin olmak için pratik gerektirir, nispeten basittir. Dikkatli kontrol deneyleri her zaman güvenilir sonuçlar elde ediliyor olmasını sağlamak için yapılması gerekir. Iyi bir şekilde başlamak için GFP-tubulin ifade mitoz embriyo yüzey (döngüleri 13 üzerinden 10) tüm döngüleri ile normal olarak devam eder emin olmak için kontrol embriyolar içine tampon veya rodamin tubulin microinjecting. Kontrolü embriyolar, genellikle çok fazla dehid…
Acknowledgements
Bu protokol şu anda bizim laboratuvarda kullanılan ve Dr David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur dahil olmak üzere pek çok kişi tarafından yıllar boyunca rafine olmuştur. Biz bu sistemde çalışma başlatılan erken Drosophila embriyoların manipülasyon ve mikroenjeksiyon (bkz. 13) mükemmel tavsiye bize sağladığı Dr Bill Sullivan (UCSC) teşekkür ederim. Biz tüm üyelerine Scholey laboratuvar teşekkür ediyorum. Drosophila mitoz üzerinde yaptığımız çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe GM55507 tarafından destekleniyor .
Riferimenti
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
