L'analyse de l'ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères
Summary
Cet article décrit la GFP basée sur la fluorescence<em> In vivo</em> Dosages qui part de quantifier la recombinaison homologue et non homologue fin de rejoindre dans les cellules de mammifères.
Abstract
L'ADN des cassures double brin sont les lésions de l'ADN le plus dangereux qui peuvent conduire à une perte massive de l'information génétique et la mort cellulaire. CDB à réparer les cellules en utilisant deux voies principales: la fin non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH). Perturbations du NHEJ et RH sont souvent associés au vieillissement prématuré et la tumorigenèse, il est donc important d'avoir un moyen quantitatif de la mesure de chaque voie de réparation ORD. Notre laboratoire a développé des constructions rapporteurs fluorescents qui permettent de mesurer sensible et quantitative du NHEJ et RH. Les constructions sont basées sur un gène de la GFP conçu contenant des sites de reconnaissance pour une rare coupe I-Scel endonucléase pour l'induction de CDB. Les constructions de départ sont GFP négatifs comme le gène de la GFP est inactivé par un exon supplémentaire, ou par des mutations. Réparation réussie des pauses I-Scel induite par NHEJ ou HR restaure le gène de la GFP fonctionnelle. Le nombre de cellules GFP-positives comptées par cytométrie en flux permet une mesure quantitative du NHEJ ou l'efficacité des ressources humaines.
Protocol
Discussion
Les fluorescents NHEJ et analyses HR Reporter fournir un moyen quantitatif pour mesurer séparément chaque voie de réparation ORD in vivo. Les tests sont très sensibles, comme FACS peut détecter de façon fiable 10 cellules GFP + dans 20.000 cellules. Les dosages peuvent être adaptés pour mesurer des événements de réparation en "temps réel" en détectant l'apparition de cellules GFP + dans les minutes ou heures après l'induction de CDB 2. Par ailleurs, l'analyse de ce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'original GFP-Pem1 était un don du Dr. Li Lei. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH et le Ellison Medical Foundation à VG et AS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Riferimenti
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
