Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte Fluoreszenz-<em> In vivo</em> Assays, die separat homologe Rekombination zu quantifizieren und homologe end joining in Säugetierzellen.
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche sind die gefährlichsten DNA-Läsionen, die zu einem massiven Verlust an genetischer Information und Zelltod führen kann. Zellen zu reparieren DSBs mit zwei Hauptwege: homologe Ende (NHEJ) und homologe Rekombination (HR). Störungen der NHEJ und HR sind oft mit vorzeitiger Alterung und Tumorgenese verbunden, daher ist es wichtig, eine quantitative Methode zur Messung der einzelnen DSB-Reparatur-Weg haben. Unser Labor hat fluoreszierenden Reporter-Konstrukte, die empfindliche und quantitative Messung der NHEJ und HR erlauben entwickelt. Die Konstrukte werden auf ein konstruiertes GFP-Gen enthält Erkennungsstellen für eine selten-Schneiden I-SceI-Endonuklease für die Induktion von DSB basieren. Der Ausgangspunkt Konstrukte GFP negativ, wie das GFP-Gen durch ein zusätzliches Exon inaktiviert wird, oder durch Mutationen. Erfolgreiche Reparatur der I-SceI-induzierten bricht durch NHEJ oder HR stellt die funktionelle GFP-Gen. Die Zahl der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt bietet quantitatives Maß für NHEJ oder HR-Effizienz.
Protocol
Discussion
Die fluoreszierenden NHEJ und HR-Reporter-Assays bieten eine quantitative Weise gesondert Messen jeder DSB-Reparatur-Weg in vivo. Die Assays sind sehr empfindlich, wie FACS zuverlässig erkennen können 10 GFP +-Zellen in 20.000 Zellen. Die Tests können zur Messung der Reparatur Ereignisse in "real time" durch den Nachweis der Auftritt von GFP +-Zellen innerhalb von Minuten oder Stunden nach der Induktion von DSB 2 angepasst werden. Darüber hinaus ist die Analyse der GFP +-Zellen nicht au…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die ursprüngliche GFP-Pem1 war ein Geschenk von Dr. Lei Li. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Riferimenti
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
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