Questo articolo descrive GFP-based fluorescenza<em> In vivo</em> Test che separatamente quantificare ricombinazione omologa e nonhomologous fine unirsi in cellule di mammifero.
Abstract
DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più pericolosa che può causare la perdita massiccia di informazioni genetiche e morte cellulare. DSB riparare le cellule utilizzando due percorsi principali: nonhomologous fine unirsi (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR). Perturbazioni di NHEJ e HR sono spesso associate a invecchiamento precoce e tumorigenesi, quindi è importante avere un modo quantitativo per misurare ogni percorso riparazione DSB. Il nostro laboratorio ha sviluppato costruisce giornalista fluorescenti che permettono di misurazione sensibile e quantitativa di NHEJ e HR. I costrutti si basano su un gene GFP progettato contenenti siti di riconoscimento per una rara taglio I-endonucleasi SCEI per l'induzione di DSB. I costrutti di partenza sono GFP negativi come il gene della GFP viene inattivato da un esone aggiuntivo, o da mutazioni. Riparazione di successo della I-SCEI indotta break da NHEJ o HR ripristina il gene funzionale GFP. Il numero di cellule GFP positive contati mediante citometria di flusso fornisce una misura quantitativa della NHEJ o efficienza delle risorse umane.
Protocol
In questo protocollo viene descritto il metodo per l'analisi di riparazione del DNA con DSB giornalista cromosomicamente integrato costruisce 1,2 DSB in cui sono indotti in vivo l'espressione transiente un'endonucleasi taglio raro SCEI I-3. Il test integrato offre il vantaggio di analizzare riparazione DSB nel contesto cromosomico. Tuttavia, questo protocollo richiede prolungata passaging cellula, che può essere problematico quando si lavora con le cellule primarie. <p cla…
Discussion
Le fluorescenti NHEJ e saggi giornalista HR forniscono un modo quantitativo per misurare separatamente ciascun percorso riparazione DSB in vivo. I test sono molto sensibili, come FACS di rilevare in modo affidabile 10 cellule GFP + in 20.000 cellule. Il test può essere adattato per la misurazione eventi riparazione in "tempo reale", rilevando la comparsa di cellule GFP + giro di pochi minuti o ore dopo l'induzione di DSB 2. Inoltre, l'analisi di cellule GFP + non si basa sulla prol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'originale GFP-Pem1 era un dono del Dr. Lei Li. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH e la Ellison Medical Foundation di VG e AS
Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).