Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero
Summary
Questo articolo descrive GFP-based fluorescenza<em> In vivo</em> Test che separatamente quantificare ricombinazione omologa e nonhomologous fine unirsi in cellule di mammifero.
Abstract
DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più pericolosa che può causare la perdita massiccia di informazioni genetiche e morte cellulare. DSB riparare le cellule utilizzando due percorsi principali: nonhomologous fine unirsi (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR). Perturbazioni di NHEJ e HR sono spesso associate a invecchiamento precoce e tumorigenesi, quindi è importante avere un modo quantitativo per misurare ogni percorso riparazione DSB. Il nostro laboratorio ha sviluppato costruisce giornalista fluorescenti che permettono di misurazione sensibile e quantitativa di NHEJ e HR. I costrutti si basano su un gene GFP progettato contenenti siti di riconoscimento per una rara taglio I-endonucleasi SCEI per l'induzione di DSB. I costrutti di partenza sono GFP negativi come il gene della GFP viene inattivato da un esone aggiuntivo, o da mutazioni. Riparazione di successo della I-SCEI indotta break da NHEJ o HR ripristina il gene funzionale GFP. Il numero di cellule GFP positive contati mediante citometria di flusso fornisce una misura quantitativa della NHEJ o efficienza delle risorse umane.
Protocol
Discussion
Le fluorescenti NHEJ e saggi giornalista HR forniscono un modo quantitativo per misurare separatamente ciascun percorso riparazione DSB in vivo. I test sono molto sensibili, come FACS di rilevare in modo affidabile 10 cellule GFP + in 20.000 cellule. Il test può essere adattato per la misurazione eventi riparazione in "tempo reale", rilevando la comparsa di cellule GFP + giro di pochi minuti o ore dopo l'induzione di DSB 2. Inoltre, l'analisi di cellule GFP + non si basa sulla prol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'originale GFP-Pem1 era un dono del Dr. Lei Li. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH e la Ellison Medical Foundation di VG e AS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Riferimenti
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
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- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
