Este artigo descreve GFP baseada em fluorescência<em> In vivo</em> Ensaios que quantificar separadamente recombinação homóloga e nonhomologous final juntar em células de mamíferos.
Abstract
DNA dupla fita-breaks são as lesões mais perigosas DNA que podem levar à perda maciça de informações genéticas e morte celular. Células LAP reparar usando duas vias principais: nonhomologous final juntar (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Perturbações de NHEJ e HR são frequentemente associados com o envelhecimento prematuro e tumorigênese, por isso é importante ter uma forma quantitativa de medir cada via de reparo DSB. Nosso laboratório desenvolveu constrói repórter fluorescentes que permitem a medição sensível e quantitativa de NHEJ e RH. As construções são baseadas em um gene GFP engenharia contendo sítios de reconhecimento para uma rara corte endonuclease I-SCEI para a indução de LAP. As construções de partida são GFP negativo como o gene GFP é inativado por um exon adicional, ou por mutações. Reparo com sucesso dos intervalos I-SCEI induzida por NHEJ ou HR restaura o gene GFP funcional. O número de células GFP positivas contadas por citometria de fluxo fornece uma medida quantitativa de eficiência ou NHEJ HR.
Protocol
Neste protocolo, descrevemos o método para análise de DNA de reparo DSB com o repórter cromossomicamente integrada constrói 1,2 LAP onde são induzidos in vivo pela expressão transitória uma endonuclease corte rara I-SCEI 3. O ensaio integrado oferece a vantagem de analisar reparação DSB no contexto cromossômicas. No entanto, este protocolo requer célula passaging prolongada, que pode ser problemático quando se trabalha com pilhas. Uma abordagem alte…
Discussion
O NHEJ fluorescentes e ensaios repórter HR fornecem uma maneira quantitativos para medir separadamente cada via de reparo DSB in vivo. Os ensaios são muito sensíveis, como FACS pode detectar 10 células GFP + de 20.000 células. Os ensaios podem ser adaptados para medir eventos de reparo em "tempo real" através da detecção do aparecimento de células GFP + em minutos ou horas após a indução de LAP 2. Além disso, a análise de células GFP + não depende de proliferação celular a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O original GFP-Pem1 foi um presente do Dr. Li Lei. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS
Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).