Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos
Summary
Este artigo descreve GFP baseada em fluorescência<em> In vivo</em> Ensaios que quantificar separadamente recombinação homóloga e nonhomologous final juntar em células de mamíferos.
Abstract
DNA dupla fita-breaks são as lesões mais perigosas DNA que podem levar à perda maciça de informações genéticas e morte celular. Células LAP reparar usando duas vias principais: nonhomologous final juntar (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Perturbações de NHEJ e HR são frequentemente associados com o envelhecimento prematuro e tumorigênese, por isso é importante ter uma forma quantitativa de medir cada via de reparo DSB. Nosso laboratório desenvolveu constrói repórter fluorescentes que permitem a medição sensível e quantitativa de NHEJ e RH. As construções são baseadas em um gene GFP engenharia contendo sítios de reconhecimento para uma rara corte endonuclease I-SCEI para a indução de LAP. As construções de partida são GFP negativo como o gene GFP é inativado por um exon adicional, ou por mutações. Reparo com sucesso dos intervalos I-SCEI induzida por NHEJ ou HR restaura o gene GFP funcional. O número de células GFP positivas contadas por citometria de fluxo fornece uma medida quantitativa de eficiência ou NHEJ HR.
Protocol
Discussion
O NHEJ fluorescentes e ensaios repórter HR fornecem uma maneira quantitativos para medir separadamente cada via de reparo DSB in vivo. Os ensaios são muito sensíveis, como FACS pode detectar 10 células GFP + de 20.000 células. Os ensaios podem ser adaptados para medir eventos de reparo em "tempo real" através da detecção do aparecimento de células GFP + em minutos ou horas após a indução de LAP 2. Além disso, a análise de células GFP + não depende de proliferação celular a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O original GFP-Pem1 foi um presente do Dr. Li Lei. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Riferimenti
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
