Summary
Intravital pial microcirculation में अस्थायी और स्थानिक hemodynamic और भड़काऊ घटनाओं का पालन माइक्रोस्कोपी.
Abstract
यह प्रयोगात्मक मॉडल के लिए तीव्र और जीर्ण, शारीरिक और pathophysiological hemodynamic, भड़काऊ और चयापचय की स्थिति के दौरान माउस pial microcirculation आकलन में vivo प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए डिजाइन किया गया था. एक बंद कपाल विंडो चूहों की बाईं parieto - पश्चकपाल प्रांतस्था पर रखा गया है. स्थानीय microcirculation महामारी और प्रतिदीप्ति रोशनी, और जहाजों के व्यास और लाल रक्त (आरबीसी) सेल वेग प्रदर्शन कर रहे हैं की माप का उपयोग कर खिड़की के माध्यम से वास्तविक समय में दर्ज की गई है. आरबीसी वेग वास्तविक समय पार सहसंबंध और / या फ्लोरोसेंट लेबल एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग मापा जाता है. ल्युकोसैट और प्लेटलेट pial और जहाजों छिड़काव और संवहनी रिसाव के मूल्यांकन के लिए पालन albumin FITC और विरोधी CD45-TxR एंटीबॉडी के रूप में प्रतिदीप्ति लेबल मार्करों की मदद के साथ बना रहे हैं. Microcirculation बार - बार कई दिनों में वीडियो दर्ज कर सकते हैं. हम पहली बार करीब खिड़की मस्तिष्क intravital माइक्रोस्कोपी pial प्लाज्मोडियम berghei Anka संक्रमण के दौरान चूहों में गतिशील परिवर्तन का पालन करने और दिखाने कि मुख्यमंत्री की अभिव्यक्ति microcirculatory वाहिकासंकीर्णन द्वारा विशेषता dysfunctions के साथ जुड़ा हुआ है, रक्त में गहरा कमी microcirculation अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया प्रवाह और अंततः संवहनी पतन.
Protocol
1. Craniotomy
8 - 10 सप्ताह पुराने चूहों में एक craniotomy के लिए अग्रिम में एक पहले से वर्णित के रूप में प्रदर्शन हो सकता है, सिवाय इसके कि एक टाइटेनियम बार जानवर के सिर में नहीं रखा गया है की जरूरत है. पुरानी कपाल विंडो प्रत्यारोपित होने के बाद भी महीनों pial microcirculation के एक स्थिर तैयारी परीक्षा की अनुमति है. आमतौर पर, हम कपाल विंडो आरोपण के बाद 2-3 सप्ताह के हमारे अध्ययन करते हैं.
2. Intravital माइक्रोस्कोपी
- दो - तीन सप्ताह craniotomy के बाद, शरीर के तापमान की जाँच की है और फिर माउस के साथ हल्के anesthetized है isoflurane (प्रेरण के लिए 4%, रखरखाव के लिए 1-2%). लाइट संज्ञाहरण प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान पशुओं के तनाव और बेचैनी को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- पशु तो एक stereotaxic फ्रेम और ध्यान से कान सलाखों का उपयोग सुरक्षित सिर पर प्रवण की स्थिति में रखा है. स्तर सही है और छोड़ दिया levers का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है. कोर शरीर का तापमान एक हीटिंग पैड का उपयोग कर बनाए रखा है. क्योंकि सेरेब्रल मलेरिया के साथ चूहों हाइपोथर्मिया विकसित करने के लिए, तापमान सेटिंग्स प्रत्येक जानवर के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है.
- कपाल खिड़की पर पर्ची कवर धीरे एक कपास झाड़ू खनिज तेल और खिड़की के नीचे वाहिकाओं के एक Panoramic तस्वीर एक stereomicroscope और एक डिजिटल कैमरा (Nikon Coolpix 995, जापान) की मदद के साथ लिया जाता है के साथ सिक्त के साथ साफ है. चित्र मुद्रित है, की पहचान की है और दिनांक और पोत व्यास और लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग की माप के लिए एक मानचित्र के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
- माउस तो एक intravital खुर्दबीन मंच (अनुकूलित Leica McBain, सैन डिएगो, CA) को सौंप दिया है. पानी की एक बूंद कपाल अच्छी तरह से दंत ऐक्रेलिक द्वारा गठित का लाभ लेने खिड़की पर रखा है, ध्यान निकाला जाता है. माप बाहर एक 20X (LUMPFL - wir, संख्यात्मक एपर्चर 0.6, ओलिंप) पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है. वही वाहिकाओं इतना पीछा कर रहे हैं कि उनके आधारभूत स्तर को प्रत्यक्ष तुलना किया जा सकता है छोटा सा नमूना आबादी के लिए और अधिक मजबूत आँकड़ों के लिए अनुमति देता है. छवियाँ एक डिजिटल कम रोशनी उच्च गति कैमरा (हमामात्सू C9300-221, जापान), या कम प्रकाश एनालॉग कैमरा (COHU 4815, सैन डिएगो, सीए) एक वीसीआर टेप से जुड़ा (JVC, जापान), मुद्रांकित समय (MicroImage वीडियो का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैं सिस्टम, Boyertown, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) और एक रंग मॉनिटर (PELCO, Clovis, CA). टेप रिकॉर्डिंग शुरू होने से पहले ठीक से पहचान की है, और समय स्टैम्प समय सीमा के दौरान जो ऐसी घटनाओं recoded थे दस्तावेजीकरण द्वारा घटनाओं की पहचान की अनुमति देता है.
- जहाजों की पहली जांच के लिए तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है और यदि सभी वाहिकाओं में रक्त बह रहा है. फिर, मापा जा वाहिकाओं के चयन किया है और यह venules और विभिन्न diameters के arterioles (हमारे माउस pial तैयारी में, सबसे वाहिकाओं 20 और 80μm के बीच सीमा) शामिल है और खिड़की के उजागर क्षेत्र के भीतर विभिन्न स्थानों को कवर किया जाना चाहिए. Arterioles और venules आसानी से पोत के असर में रक्त के प्रवाह (चाहे वह वितरित या रक्त एकत्र) की दिशा की जाँच द्वारा विभेदित किया जा सकता है. हमारे अध्ययन में, माप 12 वाहिकाओं में बना रहे हैं. प्रत्येक मापा जा स्थान का सटीक स्थान pial vasculature की तस्वीर में एनोटेट है.
- प्रत्येक स्थान के लिए, पोत व्यास एक छवि कतरनी डिवाइस (छवि कतरें, विस्टा इलेक्ट्रॉनिक्स, सैन डिएगो, CA) 2 का उपयोग करने के लिए मापा जाता है. पोत की छवि एक बार हाजिर चयनित है, ऊर्ध्वाधर स्थिति में गठबंधन है और छवि विरोध चरम गठबंधन कर रहे हैं और पढ़ने से प्रलेखित है हैं जब तक sheared है. यह मान प्रत्येक विशिष्ट एक लजीला व्यक्ति अंशांकन स्टेज माइक्रोमीटर (एडमंड प्रकाशिकी, Inc, Barrington, न्यू जर्सी) का उपयोग बढ़ाई लिए पिछले अंशांकन द्वारा micrometers में अनुवाद किया जा सकता है.
- प्रत्येक स्थान एरिथ्रोसाइट पर नज़र रखने के लिए कम से कम 30 सेकंड के दौरान दर्ज की गई है. ट्रैकिंग के लिए, रक्त का एक नमूना एकत्र है, और एरिथ्रोसाइट्स के साथ fluorescently लेबल डाई दिल (आण्विक जांच, Carlsbad, सीए) और पूंछ नस के माध्यम से संचार ~ .4-.5 3% के vivo एकाग्रता में एक प्राप्त carbocyanine. लेबल की कोई प्रेरणा, प्लाज्मोडियम berghei Anka (PBA) हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (मुख्य न्यायाधीश Janse और एपी वाटर्स द्वारा जमा PBA-GFP, मलेरिया अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक संसाधन केंद्र MR4, Manassas, VA से एक दान) व्यक्त के साथ संक्रमित पशुओं में सेल आवश्यक है. वीडियो छवियों प्रति सेकंड 150 तख्ते पर दर्ज हैं. इस दर वेग के निर्धारण के लिए एक वीडियो फ्रेम पर एक सेल के एक से छह छवियों 8 मिमी / एस प्राप्त करने के लिए सेट कर दिया जाता है वीडियो छवियों एडोब प्रीमियर 4.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक व्यक्तिगत कंप्यूटर के साथ digitalized रहे हैं, और xy समन्वय के लिए प्रत्येक कोशिका छवि डेटा SigmaScan प्रो 4.0 (SPSS शिकागो, आईएल) सॉफ्टवेयर 4 का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. सेल पदों मैन्युअल बजाय छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं दी है कि एक प्रशिक्षित पर्यवेक्षक की आंख के लिए किसी कक्ष के केन्द्र है, जो स्थान का एक अच्छा अनुमान देने के लिए दिखाया गया था,सामान्य में घंटे अधिक से अधिक सबसे सेल झुकाव के लिए मनाया प्रतिदीप्ति के स्थान पर मेल खाती है. प्रत्येक कक्ष के लिए स्थिति और वेग के एकाधिक determinations बना रहे हैं और मतलब आरबीसी वेग प्राप्त करने के औसत.
- जब आरबीसी वेग माप ऑफ़लाइन प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रत्येक माउस के लिए कुल प्रेक्षण समय संज्ञाहरण के cardiodepressive प्रभाव कम से कम 10-15 मिनट से अधिक नहीं करता है.
- एक बार पोत व्यास और आरबीसी वेग माप उपलब्ध हैं, प्रत्येक बर्तन में रक्त के प्रवाह की गणना सूत्र का उपयोग करके बनाया जा सकता है है: क्यू = वी एक्स π 2 (डी / 2), जहां क्यू = रक्त प्रवाह, वी = आरबीसी वेग और डी = पोत व्यास.
- इन प्रक्रियाओं के समय पर दोहराया जा सकता है. उदाहरण के लिए, सेरेब्रल मलेरिया के माउस मॉडल में, हम दैनिक माप संक्रमण के 4 दिन शुरू करते हैं. प्रत्येक माउस के लिए हर दिन प्राप्त मान 0 दिन के लिए संबंध (पूर्व संक्रमण), जो 100% हो जाता है में सामान्यीकृत कर रहे हैं.
- पोत व्यास और रक्त का प्रवाह माप के अलावा, उदाहरण के छिड़काव के बेहतर आकलन और ल्युकोसैट और / या प्लेटलेट और pial वाहिकाओं में रोलिंग पालन के विश्लेषण के लिए अतिरिक्त मूल्यांकन, प्रदर्शन कर सकते हैं. इन मापों फ्लोरोसेंट मार्करों - लेबल की मदद के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. मलेरिया के मामले में, हम भी कि GFP व्यक्त PBA तनाव का उपयोग के माध्यम से परिसंचारी या पक्षपाती परजीवी का पता लगा सकते हैं.
- छिड़काव के आकलन के लिए हम एक समाधान FITC लेबल albumin (सिग्मा, सेंट लुइस, MO 50μg/mouse), और pial वाहिकाओं हम अखिल ल्युकोसैट मार्कर CD45 टेक्सास रेड (TxR) के साथ लेबल के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए ल्युकोसैट पालन यों (प्रयोग Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). इस के लिए, (2mg/mL) albumin FITC और विरोधी CD45 पीई एंटीबॉडी के 20μL (200μg/mL) मिश्रित कर रहे हैं और पूर्व गर्म पूंछ नस में इंजेक्शन के 25μL. तब माउस तुरंत imaged किया जा सकता है, लेकिन अगर रिसाव माप ले जाएगा albumin - FITC 15 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी है. (ओमेगा ऑप्टिकल, Brattleboro, VT) XF100-2, और विरोधी CD45-TxR प्रतिदीप्ति (615nm) exited और ग्रीन (518nm) प्रतिदीप्ति albumin FITC और GFP (pRBC PBA-GFP) द्वारा उत्सर्जित का उपयोग कर कब्जा कर लिया है और चमकीला अल्फा XF42: एक चमकीला मानक के साथ कब्जा कर लिया.
- फ्लोरोसेंट लेबल albumin मर्मज्ञ वाहिकाओं सहित संवहनी नेटवर्क के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है, और यह मस्तिष्क के लिए गैर perfused या तहत perfused जहाजों की जांच करने के लिए मलेरिया जैसे रोग राज्यों में विशेष रूप से उपयोगी है. यह भी संवहनी 5 रिसाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी CD45 एंटीबॉडी की पहचान करने और ल्युकोसैट रोलिंग और pial जहाजों के लिए आसंजन यों आसान बनाते हैं. मात्रा का ठहराव में पूर्वाग्रह से बचने के लिए, हम एक ही रक्त के प्रवाह को मापने के पूर्व निर्धारित स्पॉट में रोलिंग और आसंजन यों. ल्युकोसैट आसंजन की मात्रा का ठहराव 100μm वाहिका लंबाई में leukocytes की संख्या की गणना के द्वारा किया जाता है. रोलिंग एक ही 100μm लंबाई में 30 सेकंड के दौरान रक्त, वेग की तुलना में काफी धीमी वेग में यात्रा leukocytes की संख्या की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित है.
3. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. (2.6 चरण) माउस pial संवहनी कपाल खिड़की के माध्यम से सुलभ नेटवर्क के चित्र.
चित्रा 2. (3.1-3.5 चरण) सेट का योजनाबद्ध माउस pial microcirculation के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए प्रदर्शन . : 1 intravital माइक्रोस्कोप, 2: 20X पानी विसर्जन उद्देश्य, 3: प्रकाश स्रोत, 4a: डिजिटल कैमरा कम प्रकाश उच्च गति, 4b: एनालॉग कैमरा, 5: stereotaxic फ्रेम में माउस, 6: कंप्यूटर मॉनीटर, 7: अनुरूप घसियारा दिखाने की निगरानी कैसे छवि कर्तन (तीर) वाहिका व्यास को मापने के लिए किया जाता है.
चित्रा 3. (3.6-3.8 चरण) Microvascular लाल उच्च गति प्रतिदीप्ति वीडियो रिकॉर्डिंग से रक्त कोशिका सेल ट्रैकिंग द्वारा वेग माप. एफ के लिए एक चित्र एक pial पोत के अनुक्रम छवियों, एक एकल चलती कैमरे द्वारा सूक्ष्म क्षेत्र सीमांकित पार आरबीसी दिखा रहे हैं. 15 या अधिक कोशिकाओं के क्षेत्र में अपने पूर्व कैलिब्रेटेड दूरी के साथ, पार फ्रेम पदों द्वारा फ्रेम के मैनुअल दृढ़ संकल्प, प्रत्येक पोत में एक एक्सेल स्प्रेडशीट की मदद से मतलब आरबीसी वेग की गणना की अनुमति देता है.
चित्रा 4. (3.9 चरण) डेटा प्लाज्मोडियम berghei Anka (PBA) संक्रमित चूहों (n = 5) में समय पर और uninfected नियंत्रण चूहों में एक प्रतिनिधि pial रक्त प्रवाह में परिवर्तन दिखा प्रयोग (n = 5). जबकि नियंत्रण चूहों में pial रक्त प्रवाह समय के साथ अपेक्षाकृत स्थिर है, PBA संक्रमित चूहों के रक्त के प्रवाह में कमी के रूप में चिह्नित दिखानेसेरेब्रल मलेरिया के विकास (6 दिन) के समय में. डेटा ± मतलब SEM हैं.
चित्रा 5. (4.3 चरण) प्लाज्मोडियम berghei Anka के साथ संक्रमित माउस के pial वाहिकाओं के अनुयायी leukocytes के एक बड़ी संख्या के रूप में विरोधी CD45 टेक्सास लाल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना से पता चला.
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Discussion
intravital माइक्रोस्कोपी यहाँ वर्णित विधि माउस में pial microcirculation की विस्तृत अवलोकन के लिए एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. यह जुमा व्यक्तिगत arterioles और venules और पोत व्यास, आरबीसी वेग, रक्त प्रवाह, पालन और leukocytes, प्लेटलेटों और अन्य रक्त तत्वों, संवहनी रिसाव, ऊतक पीएच और pO2 के रोलिंग जैसे मानकों के एक नंबर के परिवर्तन को मापने की अनुमति देता है और संभावित कई अन्य अनुप्रयोगों. vivo में संवहनी प्रतिक्रिया में दवा प्रशासन जैसे उपायों पर तुरंत मूल्यांकन किया जा सकता है, या रोग प्रक्रियाओं के दौरान . इसके अलावा, microcirculatory व्यवहार गतिशील समय पर किया जा सकता है पीछा किया. हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है मस्तिष्क मलेरिया के दौरान pial microcirculatory परिवर्तन के कारण पी. द्वारा अध्ययन माउस में berghei Anka, और पता चला है कि इस मॉडल में स्नायविक सिंड्रोम एक microcirculatory कम मस्तिष्क रक्त प्रवाह, vasoconstriction, बिगड़ा छिड़काव और अंततः संवहनी 6 पतन द्वारा विशेषता रोग के साथ जुड़ा हुआ है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम अनुदान R01 HL87290, R01-HL87290-S1 और LJMC करने के लिए R01-AI082610 से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Carbocyanine dye Dil | Molecular Probes, Life Technologies | D306 | |
| Albumin-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Anti-CD45-TxR Ab | Invitrogen | MCD4517 | |
| P. berghei ANKA-GFP | MR4 | MRA-865 |
References
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (15), (2008).
- Intaglietta, M., Tompkins, W. R. Microvascular measurements by video image shearing and splitting. Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).
- Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).
- Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).
- Baldwin, A. L. Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).
- Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine. Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).
