Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية
Summary
نحن تصف الأساليب بما في ذلك الاسترداد photobleaching بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) والخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) لمراقبة ديناميات البروتين في الخلايا الجنينية لونين (ES) الجذعية. ويتعزز لونين ديناميات البروتين ، الذي يعتبر واحدا من الوسائل لدراسة اللدونة لونين ، في الخلايا المحفزة.
Abstract
الاسترداد بعد مضان Photobleaching (FRAP) وخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) تمكن من دراسة ديناميات البروتين في الخلايا الحية مع جيدة القرار المكانية والزمانية. هنا نحن تصف كيفية تنفيذ FRAP والمقايسات FLIP لونين من البروتينات ، بما في ذلك H1 و HP1 في الخلايا الجنينية الماوس (ES) الجذعية. في تجربة FRAP ، يتم transfected الخلايا ، إما عابرة أو ثابت ، مع الاهتمام البروتين تنصهر مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) أو مشتقاتها (YFP ، CFP ، الكرز ، الخ). في الخلايا ، transfected الاستشعاع ، مكثفة تركز شعاع الليزر التبييض منطقة صغيرة نسبيا من الاهتمام (ROI). يتم تحديد طول الموجة الليزر وفقا لبروتين فلوري المستخدمة في الانصهار. ضوء الليزر التبييض لا رجعة فيه إشارة الفلورسنت من الجزيئات في العائد على الاستثمار ، ومباشرة بعد التبييض ، واستعادة للإشارة الفلورسنت في منطقة المبيض — هو رصدها باستخدام التصوير مرور الوقت — بوساطة استبدال جزيئات مبشور مع الجزيئات غير المبيض. ولدت في منحنيات الانتعاش مضان تقديم معلومات عن التنقل البروتين. إذا كانت الجزيئات الفلورسنت هي جامدة ، سوف يلاحظ أي انتعاش مضان. في اتباع نهج متكامل ، الخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) ، شعاع الليزر التبييض نفس المكان مرارا وتكرارا ويتم قياس كثافة إشارة في أماكن أخرى في الخلية الاستشعاع. تجارب FLIP قياس بالتالي تسوس إشارة بدلا من الانتعاش مضان ومفيدة لتحديد التنقل ، فضلا عن البروتين البروتين في رحلات مكوكية بين مقصورات الخلوية. عابر ملزم هو خاصية مشتركة من لونين المرتبطة البروتينات. على الرغم من المحتم أن جزءا كبيرا من كل من البروتين لونين لونين في أي لحظة في حالة مستقرة ، وملزم هو عابر وبروتينات أكثر لونين وارتفاع معدل دوران على لونين ، مع وقت الإقامة في ترتيب ثواني. هذه الخصائص هي حاسمة لتوليد يونة عالية في التعبير الجينوم 1. تجارب Photobleaching بالتالي فهي مفيدة بشكل خاص لتحديد اللدونة باستخدام لونين GFP الانصهار إصدارات البروتينات الهيكلية لونين ، وخصوصا في خلايا ES ، حيث تبادل ديناميكي للبروتينات لونين (بما في ذلك البروتين المغاير 1 (HP1) ، H1 هيستون رابط وhistones الأساسية) هو أعلى من 2،3 في الخلايا المتمايزة.
Protocol
Discussion
بخلاف معظم التقنيات المتاحة ، والتي تنطوي على لونين المنقى من السكان خلية أو خلايا ثابتة ، والتجارب FRAP متابعة التغيرات في ديناميات البروتين في الخلايا الحية لونين. وجدنا ديناميات البروتين لونين لتكون مؤشرا جيدا ليونة لونين. ومع ذلك ، لأنه يتطلب دمج الجينات في المصال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء Meshorer المختبر ، وخاصة شاي Melcer ، Alajem عدي ، Edupuganti رام راغو بديع Sailaja لانكا ، وآنا Mattout بيران ألفا ، لتعليقات انتقادية وتحديد مواطن الخلل في التجارب photobleaching على أساس يومي. EM هو H. R. جوزيف وبيلي براون أستاذ محاضر في علوم الحياة ومعتمد من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (ISF 943/09) ، ووزارة الصحة الإسرائيلية (6007) والاتحاد الأوروبي (IRG – 206872 و 238176) ، إسرائيل للسرطان مؤسسة أبحاث ، والمنح الداخلية طبية تطبيقية في الجامعة العبرية ومعهد أو الرعاية اسرائيل.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E., Girard, L. . Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. . Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
