漂白实验（FRAP和FLIP）来衡量生活胚胎干细胞的染色质的蛋白质动力学
Summary
我们描述漂白方法，包括荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白（翻转）监测胚胎干细胞（ES细胞）的染色质的蛋白质动力学的损失。染色质蛋白的动态，这被认为是研究染色质可塑性的手段之一，是增强多能干细胞。
Abstract
漂白后荧光恢复（FRAP）和漂白荧光丢失（FLIP），使具有良好的空间和时间分辨率的活细胞中的蛋白质动力学研究。在这里，我们描述了如何执行FRAP翻转检测和染色质蛋白，其中包括H1和HP1，在小鼠胚胎干细胞（ES）。在一个FRAP实验中，细胞转染，无论是瞬时或稳定，与一个融合绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物（YFP，CFP，樱桃等）的利益的蛋白质。在转染，荧光的细胞，强烈聚焦的激光束漂白剂的利益相对较小的区域（ROI）。选择的激光波长是根据荧光蛋白融合使用。激光光的投资回报率不可逆的漂白剂分子的荧光信号后，立即漂白，漂白面积的荧光信号的恢复 – 更换漂白漂白分子的分子介导的 – 监测使用时间的推移成像。产生的荧光恢复曲线对蛋白质的流动性提供了信息。如果荧光分子不动，无荧光的复苏将是观察。互补的方法，在漂白荧光丢失（FLIP），激光束的漂白剂在同一地点反复和信号强度测量荧光细胞。因此，翻转实验测量信号衰减而不是荧光恢复，并有助于确定蛋白质的流动性以及蛋白质，细胞车厢之间穿梭。瞬态约束力的染色质相关蛋白的共同财产。虽然每个染色质蛋白的主要部分是在任何给定时刻处于稳定状态的约束染色，绑定是暂时性的，最染色质蛋白对染色质高价成交，停留时间在几秒钟的顺序。这些属性1基因的表达产生的高可塑性的关键。漂白实验，因此特别有用，以确定染色质的可塑性，尤其是在胚胎干细胞，使用的染色质结构蛋白GFP融合版本是较高的染色质蛋白（包括异染色质蛋白1（HP1），连接器的组蛋白H1和核心组蛋白）的动态交换比2,3分化的细胞。
Protocol
Discussion
与大多数可用的技术，涉及从细胞群或固定细胞，FRAP实验纯化染色按照在活细胞中染色质的蛋白质动力学变化。我们发现染色质蛋白的动态染色质可塑性的一个良好指标。然而，因为它需要融合的兴趣与绿色荧光蛋白基因，荧光标记除了可以干扰蛋白质的功能。因此，与FRAP出发之前，该融合蛋白，必须经过严格的测试，以确保它具有相同的属性和作为其原生对应的功能。金标准将在淘汰赛细胞?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Meshorer实验室的成员，尤其是晒Melcer，阿迪Alajem，Edupuganti Raghu RAM，巴迪斯里兰卡Sailaja，安娜Mattout和阿尔瓦必然的批评和故障排除漂白实验每天。 EM是约瑟夫H和Belle R.布朗在生命科学学院的高级讲师，是由以色列科学基金会（ISF 943/09），以色列卫生部（6007）欧洲联盟（IRG – 206872和238176）的支持，以色列癌症研究基金会，内部应用性的希伯来大学和以色列精神生物学研究所的医疗补助金。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
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