胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色
Summary
我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。
Abstract
光退色後蛍光回復（FRAP）や光退色で蛍光損失（FLIP）が良好な空間分解能と時間分解能を持つ生体細胞内の蛋白質のダイナミクスの研究を可能にします。ここでは、FRAP及びマウス胚性幹（ES）細胞のH1とHP1、を含む、クロマチンタンパク質のFLIPアッセイを、実行する方法について説明します。 FRAP実験で、細胞は緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその誘導体（YFP、CFP、チェリー、など）を融合させた目的のタンパク質で、どちらか一過性または安定的に、トランスフェクトされています。トランスフェクト、蛍光細胞では、強烈な焦点レーザービームは、興味の比較的小さい領域（ROI）を漂白剤。レーザーの波長は、融合に使用する蛍光蛋白質に応じて選択されます。レーザー光が不可逆的にROI内の分子の蛍光シグナルを漂白剤と、すぐに漂白以下、漂白地域における蛍光シグナルの回復 – 無漂白の分子と漂白分子の交換によって媒介は – タイムラプスイメージングを使用して監視されます。生成された蛍光回復曲線は、タンパク質の流動性に関する情報を提供しています。蛍光分子が不動であれば、何蛍光回復は観察されません。補完的なアプローチでは、光退色における蛍光損失（FLIP）は、レーザービームは、繰り返し同じ場所を漂白し、信号強度は、他の場所で蛍光を発する細胞で測定されます。 FLIPの実験では、したがって、信号の減衰ではなく、蛍光の回復を測定し、タンパク質の移動度と同様に細胞区画を行き来し蛋白質を決定するのに便利です。一時的な結合は、クロマチン関連タンパク質の一般的なプロパティです。各クロマチン蛋白質の主要な割合が定常状態での任意の時点でクロマチンにバインドされていますが、バインディングは一時的であり、ほとんどのクロマチンタンパク質は、秒の順番で滞留時間で、クロマチン上で高い離職率を持っている。これらのプロパティは、ゲノムの式1に高い可塑性を発生させるために重要です。退色実験は、特にクロマチンタンパク質の動的な交換が（ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）、リンカーヒストンH1とコアヒストンを含む）以上であるES細胞、で、それゆえクロマチン構造蛋白質のGFP融合バージョンを使用してクロマチン可塑性を決定するために特に有用です。 2,3分化細胞に比べて。
Protocol
Discussion
細胞集団または固定化細胞、FRAP実験から精製されたクロマチンを含むほとんどの利用できる技術とは異なり、生きた細胞のクロマチン蛋白質のダイナミクスの変化に従ってください。我々はクロマチンの蛋白質のダイナミクスは、クロマチン可塑性の良い指標であることが判明。しかし、それは融合のGFPと目的の遺伝子を必要とするため、蛍光タグを追加するには、タンパク質の機能を妨げ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、批判的なコメントのためにと日常的にトラブルシューティング退色実験のため、特にMeshorer研究室のメンバーは、シャイMelcer、アディAlajem、Edupugantiラグーラム、バディスリランカSailaja、アンナMattoutとアルバBiranに感謝。 EMは、ジョセフH.とベルR.ブラウンライフサイエンスの上級講師であり、イスラエル科学財団（ISF 943/09）、保健イスラエル省（6007）欧州連合（IRG – 206872および238176）でサポートされていますイスラエル癌研究財団、ヘブライ大学、イスラエルの精神生物学研究所の内部実用的な医療補助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
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