Photobleaching Assays (FRAP & FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure
Summary
Wir beschreiben photobleaching Methoden einschließlich Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) zu Chromatin Protein Dynamik in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu überwachen. Chromatin Protein Dynamik, die als eines der Mittel, um das Chromatin Plastizität zu studieren, ist in pluripotente Zellen verbessert.
Abstract
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) ermöglichen die Untersuchung von Protein Dynamik in lebenden Zellen mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier beschreiben wir, wie FRAP und FLIP-Assays von Chromatin-Proteine, einschließlich H1 und HP1, in embryonalen Maus-Stammzellen (ES-Zellen) durchzuführen. In einem FRAP-Experiment werden die Zellen transfiziert, entweder transient oder stabil mit einem Protein von Interesse mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder deren Derivate (YFP, CFP, Kirsche, etc.) fusioniert. In den transfizierten, fluoreszierenden Zellen, Bleichmittel eine intensive fokussierte Laserstrahl einer relativ kleinen Region of Interest (ROI). Die Wellenlänge des Lasers ist nach dem fluoreszierenden Protein für die Fusion eingesetzt ausgewählt. Das Laserlicht irreversibel Bleichmittel das Fluoreszenzsignal der Moleküle in der ROI und unmittelbar nach Bleichen, die Erholung der Fluoreszenz-Signal in den gebleichten Bereich – vermittelt durch den Austausch der gebleichten Moleküle mit dem ungebleichten Moleküle – wird überwacht mit Zeitraffer-Bildgebung. Die erzeugte Fluoreszenz Erholung Kurven geben Auskunft über das Protein der Mobilität. Wenn die fluoreszierenden Moleküle unbeweglich sind, wird keine Fluoreszenz Erholung beobachtet werden. In einem komplementären Ansatz, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), Bleichmittel den Laserstrahl der gleichen Stelle wiederholt und die Signalstärke wird an anderer Stelle in der fluoreszierenden Zellen gemessen. FLIP-Experimente daher messen Signalabfall statt Fluoreszenz Erholung und sind nützlich, um Protein-Mobilität sowie Protein pendelt zwischen zellulären Kompartimenten zu bestimmen. Transient Bindung ist eine gemeinsame Eigenschaft von Chromatin-assoziierten Proteinen. Obwohl die großen Anteil der einzelnen Chromatin-Protein ist an das Chromatin zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem stabilen Zustand gebunden ist, ist die Bindung transient und die meisten Chromatin-Proteine haben eine hohe Fluktuation auf Chromatin, mit einer Verweilzeit in der Größenordnung von Sekunden. Diese Eigenschaften sind entscheidend für die Erzeugung hoher Plastizität in der Genom-Ausdruck 1. Photobleaching Experimente sind deshalb besonders nützlich, um Chromatin Plastizität mit GFP-Fusion-Versionen von Chromatin Strukturproteine, insbesondere in ES-Zellen zu bestimmen, wo der dynamische Austausch von Chromatin-Proteine (einschließlich Heterochromatin Protein 1 (HP1), Linker-Histon H1 und Core-Histonen) ist höher als in differenzierten Zellen 2,3.
Protocol
Discussion
Anders als die meisten verfügbaren Techniken, die gereinigt Chromatin beinhalten von Zellpopulationen oder fixierten Zellen, FRAP Experimente folgen Änderungen in Chromatin Protein Dynamik in lebenden Zellen. Wir fanden Chromatin Protein Dynamik ein guter Indikator für die Chromatin Plastizität werden. Da es jedoch Absicherung erfordert das Gen von Interesse mit GFP, kann die Zugabe des fluoreszierenden Tag mit der Funktionsweise des Proteins beeinträchtigen. So, bevor Sie fortfahren mit FRAP, muss das Fusionsprote…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Meshorer Labor, vor allem Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout und Alva Biran, für kritische Anmerkungen und für die Fehlersuche Bleichexperimenten auf einer täglichen Basis. EM ist ein Joseph H. und Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences und wird von der Israel Science Foundation (ISF 943/09), das Israel Ministry of Health (6007) der Europäischen Union (IRG-206872 und 238176) unterstützt, die Israel Cancer Research Foundation, die Interne Applikative Medical Grants der Hebrew University und dem Israel Institute Psychobiologie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
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