Fotobleken Analyses (FRAP & FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen
Summary
We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.
Abstract
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) kan de studie van proteïne dynamiek in levende cellen met een goede ruimtelijke en temporele resolutie. Hier beschrijven we hoe u FRAP en Flip testen van chromatine eiwitten, waaronder H1 en HP1, in de muis embryonale stamcellen (ES)-cellen uit te voeren. In een FRAP experiment worden de cellen getransfecteerd, ofwel tijdelijk of stabiel, met een eiwit van interesse gefuseerd met het groen fluorescerend eiwit (GFP) of derivaten daarvan (YFP, GVB, Cherry, etc.). In de getransfecteerde, fluorescerende cellen, een intense gerichte laserstraal bleekmiddelen een relatief klein gebied van de interest (ROI). De laser golflengte wordt gekozen op basis van het fluorescerende eiwit dat wordt gebruikt voor de fusie. Het laserlicht onomkeerbaar het fluorescerende signaal van moleculen bleekmiddelen in de ROI en, direct na het bleken, het herstel van het fluorescerende signaal in het gebleekte gebied – gemedieerd door de vervanging van de gebleekte moleculen met de ongebleekte moleculen – is gecontroleerd met behulp van time lapse imaging. De gegenereerde fluorescentie herstel curves geven informatie over de mobiliteit van het eiwit. Als de fluorescerende moleculen zijn onbeweeglijk, zal er geen fluorescentie herstel worden waargenomen. In een complementaire aanpak, Fluorescentie Verlies in Photobleaching (FLIP), de laserstraal bleekt op dezelfde plek herhaaldelijk en de intensiteit van het signaal is elders in de fluorescerende cel gemeten. FLIP experimenten dan ook te meten signaal verval in plaats van fluorescentie herstel en zijn nuttig om eiwit mobiliteit en eiwitten pendelt tussen cellulaire compartimenten te bepalen. Transient binding is een gemeenschappelijke eigenschap van chromatine-geassocieerde eiwitten. Hoewel het belangrijkste deel van elk chromatine eiwit is gebonden aan chromatine op elk gewenst moment bij steady state, de binding is van voorbijgaande aard en de meeste chromatine-eiwitten hebben een hoge omzet van chromatine, met een verblijftijd in de orde van seconden. Deze eigenschappen zijn cruciaal voor het genereren van hoge plasticiteit in het genoom van meningsuiting 1. Fotobleken experimenten zijn dan ook bijzonder nuttig om chromatine plasticiteit met behulp van GFP-fusie-versies van chromatine structurele eiwitten, vooral in ES-cellen, te bepalen waar de dynamische uitwisseling van chromatine-eiwitten (waaronder heterochromatine eiwit 1 (HP1), linker histon H1 en kern histonen) is hoger dan in de gedifferentieerde cellen 2,3.
Protocol
Discussion
Tegenstelling tot de meeste beschikbare technieken, die gezuiverd chromatine betrekken van cel populaties of vaste cellen, FRAP experimenten volgen veranderingen in het chromatine eiwit dynamiek in levende cellen. We vonden chromatine eiwit dynamiek om een goede indicator voor het chromatine plasticiteit zijn. Echter, omdat het vereist het fuseren van de gen van belang met GFP, kan de toevoeging van de tl-tag interfereren met de functie van het eiwit. Dus, voordat u verdergaat met FRAP, moet het fusie-eiwit rigour…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Meshorer lab, in het bijzonder Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout en Alva Biran, voor kritische opmerkingen en voor trouble-shooting fotobleken experimenten op een dagelijkse basis. EM is een Joseph H. en Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences en wordt ondersteund door de Israel Science Foundation (ISF 943/09), het Israëlische ministerie van Volksgezondheid (6007) de Europese Unie (IRG-206872 en 238176), de Israëlische Cancer Research Foundation, de interne Applicatieve Medical Subsidies van de Hebreeuwse Universiteit en het Israel Institute Psychobiologie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E., Girard, L. . Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. . Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
