Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires
Summary
Nous décrivons les méthodes de récupération, y compris photoblanchiment de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) pour suivre la dynamique des protéines dans la chromatine souches embryonnaires (ES) cellules. La dynamique des protéines de la chromatine, ce qui est considéré comme l'un des moyens d'étudier la plasticité de la chromatine, est augmentée dans les cellules pluripotentes.
Abstract
Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) permettra l'étude de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale et temporelle bien. Nous décrivons ici comment effectuer FRAP et FLIP dosages des protéines de la chromatine, notamment H1 et HP1, chez la souris souches embryonnaires (ES) cellules. Dans une expérience de FRAP, les cellules sont transfectées, soit transitoire ou stable, avec une protéine d'intérêt fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou leurs dérivés (YFP, CFP, cerise, etc.) Dans le transfectées, les cellules fluorescentes, un faisceau laser intense concentré blanchit une région relativement petite d'intérêt (ROI). La longueur d'onde laser est choisie en fonction de la protéine fluorescente utilisée pour la fusion. La lumière du laser blanchit de manière irréversible le signal de fluorescence des molécules dans le retour sur investissement et, immédiatement après le blanchiment, la récupération du signal fluorescent dans la zone blanchie – médiatisé par le remplacement des molécules blanchie avec les molécules non blanchie – est contrôlée au moyen d'imagerie laps de temps. Les courbes générées récupération de fluorescence fournir des informations sur la mobilité de la protéine. Si les molécules fluorescentes sont immobiles, aucune récupération de fluorescence est observée. Dans une approche complémentaire, la perte de fluorescence dans le Photobleaching (FLIP), le faisceau laser blanchit au même endroit à plusieurs reprises et l'intensité du signal est mesuré ailleurs dans la cellule fluorescente. Expériences FLIP donc mesurer la carie signal plutôt que la récupération de fluorescence et sont utiles pour déterminer la mobilité des protéines ainsi que la protéine navette entre compartiments cellulaires. Contraignante transitoire est une propriété commune de la chromatine protéines associées. Bien que la fraction majeure de chaque protéine chromatine est lié à la chromatine à tout moment à l'état stationnaire, la liaison est transitoire et la plupart des protéines de chromatine ont un chiffre d'affaires élevé sur la chromatine, avec un temps de séjour dans l'ordre des secondes. Ces propriétés sont cruciales pour générer une grande plasticité dans l'expression du génome 1. Expériences de photoblanchiment sont donc particulièrement utiles pour déterminer la plasticité chromatinienne utilisant la GFP-fusion des versions de la chromatine des protéines structurelles, en particulier dans les cellules ES, où l'échange dynamique de protéines de chromatine (y compris les protéines hétérochromatine 1 (HP1), un linker histone H1 et histones) est plus élevé que dans les cellules différenciées 2,3.
Protocol
Discussion
Contrairement à la plupart des techniques disponibles, qui impliquent la chromatine purifiée à partir de populations de cellules ou de cellules fixes, des expériences FRAP suivre l'évolution de la dynamique des protéines de la chromatine dans les cellules vivantes. Nous avons trouvé la dynamique des protéines de chromatine d'être un bon indicateur de la plasticité chromatinienne. Cependant, parce qu'il exige la fusion des gènes d'intérêt avec la GFP, l'ajout du marqueur fluorescent peut …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Meshorer, surtout Shai Melcer, Adi Alajem, Raghu Ram Edupuganti, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout et Alva Biran, pour les commentaires critiques et pour le dépannage des expériences de photoblanchiment sur une base quotidienne. EM est un H. Joseph et Belle R. Braun Senior Lecturer en Sciences de la Vie et est soutenu par la Fondation des sciences d'Israël (ISF 943/09), le ministère israélien de la Santé (6007) de l'Union européenne (IRG-206872 et 238176), l'Israel Cancer Research Foundation, l'interne Applicative Subventions de médecine de l'Université hébraïque et de la psychobiologie Institut israélien.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
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