אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.
שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) לאפשר את לימוד הדינמיקה חלבון בתאים חיים עם רזולוציה במרחב ובזמן טוב. כאן אנו מתארים כיצד לבצע FRAP מבחני FLIP של חלבונים הכרומטין, כולל H1 ו HP1, בעכבר גזע עובריים (ES) התאים. בניסוי FRAP, תאים transfected, או transiently או ביציבות, עם חלבון של עניין התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או נגזרים ממנו (YFP, CFP, שרי וכו '). ב, תאים transfected fluorescing, קרן לייזר ממוקדת הלבנה אינטנסיבי באזור קטן יחסית של עניין (ROI). אורך גל לייזר נבחרה על פי חלבון פלואורסצנטי המשמש היתוך. אור לייזר בלתי הפיך הלבנה אות הניאון של מולקולות ROI ו, מיד לאחר הלבנה, ההתאוששות של האות ניאון באזור מולבן – מתווכת על ידי החלפתו של מולקולות מולבן עם מולקולות מולבן – מנוטר באמצעות לשגות הדמיה הזמן. עקומות שנוצר התאוששות הקרינה לספק מידע על ניידות של החלבון. אם מולקולות ניאון הם נייח, ההחלמה לא הקרינה יקויימו. בגישה משלים, אובדן הקרינה photobleaching (FLIP), קרן הלייזר הלבנה באותו מקום שוב ושוב את עוצמת האות נמדדת במקום אחר בתא fluorescing. ניסויים FLIP ולכן למדוד דעיכה אות ולא התאוששות פלואורסצנטי מועילים כדי לקבוע ניידות חלבון, כמו גם חלבון מדלג בין תאים סלולריים. מחייב חלוף הוא רכוש משותף של הכרומטין הקשורים חלבונים. אמנם חלק גדול של כל חלבון הכרומטין חייב הכרומטין בכל רגע נתון על מצב יציב, מחייב הוא חולף וחלבונים הכרומטין ביותר יש תחלופה גבוהה על הכרומטין, עם זמן מגורים בסדר גודל של שניות. מאפיינים אלה הם קריטיים ליצירת גמישות גבוהה בביטוי הגנום 1. ניסויים photobleaching ולכן הם יעילים במיוחד כדי לקבוע פלסטיות הכרומטין באמצעות GFP-Fusion גירסאות של חלבונים מבניים הכרומטין, במיוחד בתאי גזע עובריים, שם החליפין הדינמי של חלבונים הכרומטין (כולל חלבון heterochromatin 1 (HP1), היסטון H1 מקשר ו ההיסטונים הליבה) גבוה מ בתאים הבדיל 2,3.
שלא כמו בשיטות הזמינות ביותר, אשר כרוך הכרומטין מטוהרים מן אוכלוסיות תאים או תאים קבוע, ניסויים FRAP בעקבות שינויים הדינמיקה חלבון הכרומטין בתאים חיים. מצאנו הדינמיקה הכרומטין חלבון להיות אינדיקטור טוב עבור פלסטיות הכרומטין. עם זאת, מכיוון שהיא דורשת פיוזינג את הגן של…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדה משורר, במיוחד שי מלצר, עדי Alajem, Edupuganti ראגו רם, באדי סרי Sailaja, אנה Mattout ואלווה בירן, הערות ביקורתיות עבור בעיות הירי ניסויים photobleaching על בסיס יומי. EM מהווה ח ר 'יוסף בל בראון מרצה בכיר למדעי החיים והוא נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (ISF 943/09), את משרד הבריאות (6007) האיחוד האירופי (IRG-206872 ו 238176), למלחמה בסרטן Research Foundation, מענקים פנימי רפואי יישומי של האוניברסיטה עברית ואת הפסיכו המכון הישראלי.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
DMEM | Sigma | D5671 |
Gelatin | Merck | 1.04078 |
Opti-MEM | Gibco | 31985 |
TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |