زيادة غلال [كدنا] من خلية واحدة كميات مرنا في مختبر قياسي ردود الفعل الناسخ العكسي باستخدام Microstreaming الصوتية
Summary
نحن تصف طريقة جديدة لزيادة الغلة من [كدنا] وحيدة الخلية كميات مرنا في مستوى ردود الفعل على خلاف ذلك المختبر النسخ العكسي. الجدة تكمن في استخدام micromixer ، الذي يستخدم لظاهرة microstreaming الصوتية ، لخلط السوائل في جداول ميكروليتر أكثر فعالية من الهز ، أو vortexing سحن.
Abstract
ويتم الربط بشكل مثالي مع سلوك التعبير الجيني على مستوى الخلايا وحيدة الخلية. ومع ذلك ، لم يتم تحقيق ذلك بسهولة لأن كمية صغيرة من مرنا عطوب موجودة في خلية واحدة (1-5 ٪ من الحمض النووي الريبي 1 – 50pg الكلي ، أو مرنا 0.01 – 2.5pg ، لكل خلية 1) قبل أن يحط في معظمها يمكن عكس كتب [كدنا] في نسخة مستقرة. على سبيل المثال ، باستخدام الكواشف المخبرية والأجهزة القياسية ، ويمكن أن يكون سوى عدد صغير من الجينات المقررة نوعيا في الخلية 2. وإحدى الطرق لزيادة كفاءة مستوى ردود الفعل العكسي المختبرات (RT) الناسخ (أي معيار الكواشف بكميات ميكروليتر) وحيدة الخلية تتألف من مبالغ ليكون مرنا بسرعة أكبر مزج الكواشف بحيث يمكن تحويلها إلى مرنا [كدنا] قبل أن يتحلل. لكن هذه ليست تافهة لأن في موازين ميكروليتر تدفق السائل الصفحي ، أي الطرق المتاحة حاليا من الاختلاط (أي الهز ، وسحن vortexing) تفشل لانتاج الحركة الفوضوية بفعالية كافية لخلط الكواشف. لحل هذه المشكلة ، الصغيرة الحجم تقنيات الخلط يجب أن تستخدم 3،4. وقد تم تطوير عدد من التكنولوجيات المستندة ميكروفلويديك الاختلاط الذي زيادة غلة رد فعل بنجاح RT 5-8. ومع ذلك ، والتكنولوجيات على microfluidics تتطلب أجهزة متخصصة مكلفة نسبيا والتي لا تتوافر حتى الآن على نطاق واسع. حل أرخص وأكثر ملاءمة هو مرغوب فيه. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو لشرح كيفية تطبيق تقنية رواية "micromixing" لردود الفعل القياسية RT مختبر وحيد الخلية تضم كميات مرنا بشكل ملحوظ زيادة عائداتها [كدنا]. نجد زيادة غلة [كدنا] من قبل ما يقرب من 10 أضعاف – 100 ، التي تمكن : (1) عدد أكبر من الجينات لتحليلها في كل خلية ، (2) التحليل الكمي لمزيد من التعبير الجيني ، و (3) تحسين كشف منخفضة وفرة الجينات في الخلايا واحد. يستند على micromixing الصوتية microstreaming 9-12 ، حيث ظاهرة الموجات الصوتية نشر حول عقبة صغيرة خلق تدفق يعني قرب العقبة. طورنا الصوتية microstreaming المستندة إلى الجهاز ("micromixer") مع تبسيط المفتاح ، ويمكن تحقيقه microstreaming الصوتية على ترددات الصوت من خلال ضمان نظام يحتوي على واجهة الهواء السائل مع قليل من دائرة نصف قطرها 13 انحناء. في الغضروف المفصلي لحجم ميكروليتر من محلول في أنبوب يوفر نصف قطرها صغير مناسب للانحناء. استخدام الترددات السمعية يعني أن الأجهزة غير مكلفة ويمكن تنوعا 13 ، وليست معطوبة الأحماض النووية والكواشف الكيميائية الحيوية الأخرى مثل أنها يمكن أن تكون مع sonicators المختبر القياسية.
Protocol
Discussion
ووصف طريقة تطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT مختبر هنا يمكن ، بطبيعة الحال ، ينطوي مرنا تحصد عبر أي وسيلة (مثل انحلال الخلايا الطبيعية الليزر ، microdissection). يمكن أن تشمل أيضا أية علامات أو أنواع الكواشف RT ، أي درجة الحرارة (في التسامح من المواد من micromixer) ، ولأي فترة من الزم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (مشروع منحة رقم 6288480) وسكوبي وكلير الاستئماني ماكينون.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
Riferimenti
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. . Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. . Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. . J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. . Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. . Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. . Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. . Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O’Hara, M. J., Peper, S. M. . Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. a. b. . 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. . 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. . 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. . Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. . Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
