הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית
Summary
אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.
Abstract
ביטוי גנים correlating עם התנהגות התא נעשית באופן אידיאלי ברמת מתחיל מתא בודד. עם זאת, זו אינה מושגת בקלות כי כמות קטנה של mRNA יציב נוכח בתא בודד (1-5% של 1-RNA 50pg הכולל, או 0.01-mRNA 2.5pg, לכל תא 1) בעיקר מדרדרת לפני שניתן יהיה להפוך עיבד לתוך עותק cDNA יציב. לדוגמה, באמצעות ריאגנטים מעבדה סטנדרטיים החומרה, רק מספר קטן של גנים ניתן להעריך איכותית לכל תא 2. דרך אחת להגביר את היעילות של תקן מעבדה הפוכה transcriptase (RT) תגובות (ריאגנטים כלומר תקן בכמויות microliter) הכולל תא בודד כמויות של mRNA יהיה במהירות רבה יותר בתמהיל ריאגנטים כך את ה-mRNA ניתן להמיר cDNA לפני שהיא מדרדרת. אולם זה לא טריוויאלי כי בקני מידה microliter זרימת הנוזל היא למינרית, כלומר השיטות הקיימות כיום של ערבוב (כלומר רועד, vortexing ו טחינה דקה) לא מצליחים לייצר תנועה כאוטית מספיק ביעילות לערבב חומרים כימיים. כדי לפתור בעיה זו, מיקרו בקנה מידה טכניקות ערבוב צריך לשמש 3,4. מספר microfluidic טכנולוגיות מבוססות ערבוב אשר פותחו בהצלחה להגדיל את התשואות RT תגובה 5-8. עם זאת, טכנולוגיות מיקרופלואידיקה דורשים חומרה מיוחדת, כי הוא יקר יחסית, עדיין אינו זמין באופן נרחב. פתרון זול יותר, נוח יותר רצוי. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים כיצד היישום של טכניקה חדשנית "micromixing" לתגובות מעבדה סטנדרטיים RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA מגביר באופן משמעותי בתשואות cDNA שלהם. אנו מוצאים תשואות cDNA להגדיל בכ 1-10 כפולה, המאפשרת: (1) במספרים גדולים יותר של גנים כדי להיות מנותח לכל תא, (2) ניתוח כמותי יותר של ביטוי גנים; ו (3) זיהוי טוב יותר נמוכה שפע גנים בתוך תאים בודדים. Micromixing מבוססת על אקוסטית microstreaming 9-12, תופעה שבה גלי הקול מתפשט סביב מכשול קטן ליצור זרימה מתכוון ליד המכשול. פיתחנו מכשיר אקוסטי microstreaming מבוססות ("micromixer"), עם פישוט מפתח: microstreaming אקוסטי ניתן להשיג בתדרים אודיו ידי הבטחת למערכת יש ממשק נוזלי אוויר עם רדיוס עקמומיות קטן של 13. המניסקוס של נפח microliter של פתרון צינור מספק רדיוס קטן כראוי של עקמומיות. השימוש בתדרי שמע כלומר החומרה יכול להיות זולה צדדי 13, וחומצות גרעין ו ריאגנטים ביוכימיים אחרים אינם פגומים כמו שהם יכולים להיות עם sonicators מעבדה סטנדרטיים.
Protocol
Discussion
שיטת היישום של micromixing לרמת התגובות מעבדה RT המתואר כאן יכול, כמובן, כרוך mRNA שנקטפו באמצעות שיטה כלשהי (למשל תמוגה התא, לייזר microdissection ללכוד). זה גם יכול לכלול כל המותגים או סוגי RT ריאגנטים, כל טמפרטורה (תוך סובלנות של החומרים של micromixer), וכל תקופה. לדוגמה, ראינו שיפור התשואו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (הפרויקט להעניק אין. 6288480) ואת סקובי וקלייר מקינון אמון.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
Riferimenti
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. . Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. . Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. . J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. . Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. . Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. . Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. . Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O’Hara, M. J., Peper, S. M. . Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. a. b. . 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. . 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. . 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. . Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. . Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
