增加从单细胞的数量标准实验室逆转录反应的mRNA的cDNA产量，使用声Microstreaming
Summary
我们描述了一个从单细胞的mRNA数量增加在其他标准的实验室逆转录反应的cDNA产量的新方法。求新驻留在一个微混合器的使用，它采用的声学microstreaming现象，微升尺度混合流体比摇晃，震荡或trituration更有效。
Abstract
细胞的行为及其相关基因表达的理想是做在单细胞水平。然而，这是不容易实现的，因为少量不稳定的mRNA在一个单元格（1 – 50pg总RNA的1-5％，或0.01 – 2.5pg的mRNA，每单元 1）目前大多降低，然后才可以反转录进入一个稳定的基因复制。例如，使用标准的实验室试剂和硬件，只有少数基因可以定性评估每单元 2 。一种方式来提高效率标准的实验室逆转录（RT）的反应，包括单细胞mRNA的金额（即标准试剂微升卷）将更加迅速地混合使用的试剂，使可转换的mRNA为cDNA，然后它会降低。然而，这是不平凡的，因为在微升尺度液体流动层，即目前可用混合方法（即晃动，涡旋和trituration）不能产生足够的混沌运动，有效地组合试剂。为了解决这个问题，微观尺度的混合技术也将用于 3,4 。已开发的基于微流体混合技术，成功地增加RT反应产率 5-8 。然而，微流体技术需要专门的硬件是相对昂贵，尚未广泛使用。一个更便宜，更方便的解决方案是可取的。这项研究的主要目的是演示了如何应用小说“的微观”的技术标准实验室RT反应包括单细胞的mRNA数量大大增加了他们的cDNA产量。我们发现cDNA的产量增加约10 – 100倍，从而使：（1）更大的数字分析每个细胞的基因;（2）基因表达的定量分析;（3）更好的低丰度基因检测在单细胞。的微观是基于声microstreaming 9-12，声波传播围绕一个小的障碍，创建一个障碍物附近的平均流量的现象。我们已经开发出一个关键的简化声microstreaming为基础的装置（“微混合器”）;声microstreaming可以确保系统中有一个小半径曲率 13的液气界面在音频实现。在管的解决方案微升量的半月板提供了一个适当的曲率半径小。音频频率的使用，意味着硬件可以廉价和通用的13，和不被损坏，像他们可以与标准实验室sonicators核酸和其他生化试剂。
Protocol
Discussion
应用标准实验室RT反应的微观描述的方法可以，当然，涉及的mRNA通过任何方法（如细胞裂解，激光捕获显微切割）的收获。它也可以包括任何品牌或类型的RT试剂，任何温度（微混合器的材料的承受能力范围内），和任何时期。例如，我们已经看到了包括随机六聚体或寡DT引物的RT反应的cDNA产量提高。它也可能被应用到其他生化转换（例如DNA杂交15），符合以下限制。当前技术的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到国家卫生和医学研究理事会澳大利亚（项目赠款。6288480）和Scobie和克莱尔麦金农信托。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
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