Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması
Summary
Biz aksi takdirde standart laboratuvar ters transkripsiyon reaksiyonları mRNA tek hücreli miktarda cDNA verimi artırmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Yenilik, titreme, vorteks veya öğütme daha etkili mikrolitrelik ölçekler sıvıları karıştırmak için, akustik microstreaming fenomeni kullanan bir micromixer, kullanımı bulunur.
Abstract
Gen ekspresyonu hücre davranışı ile ilişkilendirerek ideal tek hücre düzeyinde yapılır. Ancak, tek bir hücrenin (1-5, 1-50pg toplam RNA ya da% 0.01-2.5pg mRNA, hücre başına 1) mevcut labil mRNA transkripsiyonu tersine çevirmek için önce küçük bir miktar daha çok düşürür, çünkü bu kolayca elde değil . istikrarlı bir cDNA kopyası haline. Örneğin, standart laboratuar reaktifleri ve donanım kullanarak, genlerin sadece az sayıda hücre başına 2 nitel değerlendirilir olabilir. MRNA tek hücreli miktarda oluşan standart laboratuvar ters transkriptaz (RT) reaksiyonlar (mikrolitrelik hacimleri yani standart reaktifler) verimliliği artırmak için bir şekilde düşürür önce mRNA cDNA dönüştürülebilir, böylece daha hızlı reaktifler karıştırmak olacaktır. Ancak mikrolitrelik ölçekler sıvı akışı laminer olduğunu, çünkü bu önemsiz değildir, yani mevcut karıştırma yöntemleri (sallayarak, vorteks ve öğütme yani), etkin bir şekilde reaktifleri karıştırmak için yeterli kaotik hareket üretemez. Bu sorunu çözmek için, mikro ölçekli karıştırma teknikleri 3,4 kullanılır. Mikroakışkan tabanlı karıştırma teknolojileri başarıyla RT reaksiyon verimi 5-8 artış geliştirilmiştir. Ancak, Mikroakiskan teknolojileri, nispeten pahalı ve henüz yaygın değil özel bir donanım gerektirir. Daha ucuz, daha rahat bir çözüm arzu edilir. Bu çalışmanın ana amacı, mRNA tek hücreli miktarlarda oluşan standart laboratuvar RT reaksiyonlar bir romanı "micromixing" tekniği uygulaması cDNA verimi önemli ölçüde artırır nasıl göstermektir. Biz cDNA verim sağlar yaklaşık 10-100-katlama, artış bulabilirsiniz: (1) daha fazla sayıda hücre başına analiz edilmesi gereken genler, gen ekspresyonu (2) daha düşük bolluk genlerin kantitatif analiz ve (3) daha iyi algılama tek hücre. Micromixing akustik, 9-12 küçük bir engel etrafında yayılan ses dalgalarını engel yakın bir ortalama akışı oluşturmak bir fenomen microstreaming dayanmaktadır. Biz kilit bir sadeleştirme ile akustik bir microstreaming tabanlı cihaz ("micromixer"); akustik microstreaming sistemi, küçük bir eğrilik 13 yarıçapı ile bir sıvı-hava arayüzü sağlayarak ses frekansları elde edilebilir . Bir tüp bir çözüm mikrolitrelik hacmi menisküs uygun küçük bir eğrilik yarıçapı sağlar. Ses frekanslarının kullanımı, donanım ucuz ve 13 çok yönlü olması anlamına gelir ve standart laboratuvar sonicators olabileceği gibi, nükleik asitler ve diğer biyokimyasal reaktifler zarar görmezler.
Protocol
Discussion
Standart laboratuvar RT reaksiyonlara micromixing uygulama yöntemi, tabii ki, tutabilen burada açıklanan herhangi bir yöntemle (örneğin, hücre parçalama, lazer yakalama mikrodiseksiyon) ile hasat mRNA. Aynı zamanda herhangi bir marka veya türleri RT reaktifleri, herhangi bir sıcaklık (micromixer malzemelerin tolerans içinde), ve herhangi bir süre oluşur. Örneğin, RT rastgele hexamer veya oligo-dT primerleri oluşan reaksiyonlar gelişmiş cDNA verim gözlemledik. Aşağıdaki kısıtlamalara uygun diğe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi Avustralya (proje hibe hayır °. 6.288.480) ve Scobie ve Clare MacKinnon Güven tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
Riferimenti
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. . Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. . Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. . J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. . Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. . Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. . Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. . Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O’Hara, M. J., Peper, S. M. . Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. a. b. . 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. . 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. . 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. . Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. . Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
