アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる
Summary
我々は、そうでなければ標準的な実験の逆転写反応でmRNAの単一セルの量からcDNA収量を増加させるための新しい方法を説明します。目新しさは、ボルテックスまたは粉砕、揺れよりも効果的にマイクロリットルスケールでの流体を混合するために、音響microstreamingの現象を利用したマイクロミキサーの使用に存在する。
Abstract
細胞の挙動との相関遺伝子発現は、理想的には単一細胞レベルで行われます。それが転写を逆にすることができます前に、単セル（1-5 1 – 50pgのトータルRNAの％、または0.01 – 2.5pg mRNAは、セル1あたり）に存在する不安定なmRNAの少量がほとんど劣化するため、これは容易に達成されていません安定したcDNAコピーに。例えば、標準的な実験用試薬とハードウェアを使用して、遺伝子のわずかな数は、定性的にセル2ごとに評価することができます。 mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験の逆転写酵素（RT）反応（マイクロリットルの量で、すなわち標準試薬）の効率を向上させる一つの方法は、それが低下する前にmRNAをcDNAに変換できるので、より迅速に試薬を混合することです。しかし、マイクロリットルスケールでの液体の流れが層流であるため、これは自明ではない、すなわち混合の現在利用可能なメソッド（、揺れボルテックスと粉砕つまりは）効果的に試薬を混合するために十分なカオス運動を生成するために失敗する。この問題を解決するために、マイクロスケールの混合技術は、3,4を使用する必要があります。マイクロ流体ベースのミキシング技術の数が正常にRT反応の収量5-8を増加させるが開発されている。しかし、マイクロ流体技術は、比較的高価であり、まだ広く利用できない特殊なハードウェアを必要とする。安く、より便利なソリューションが望まれる。本研究の主な目的は、mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験RT反応の小説"マイクロミキシング"技術の応用が著しく、そのcDNA収量を増加させる方法を説明することです。遺伝子発現の解析（2）より多くの定量;（1）セルごとに分析される遺伝子の大きい数と発現量の低い遺伝子の（3）良好な検出：我々は、cDNAの収量が可能な約10 100倍、増加見つける単一細胞インチマイクロミキシングは音響は、9-12小障害物の周りに伝播する音波が障害物の近くに平均流を作る現象をmicrostreamingに基づいています。我々は、主要な簡素化と音響microstreamingベースのデバイスを（"マイクロミキサー"）を開発しました。音響microstreamingは、システムが湾曲13の小さな半径を持つ液体-空気界面を持って確保することによってオーディオ周波数で達成することができます。チューブ内の溶液のマイクロリットルの容積のメニスカスの曲率の適切な小さい半径を提供します。オーディオ周波数の使用は、ハードウェアが安価と13の多彩なことができる、と彼らは標準的な実験室sonicatorsとすることができるように、核酸と他の生化学試薬が破損していないことを意味します。
Protocol
Discussion
ここで説明する標準的な実験RT反応にマイクロミキシングのアプリケーションの方法は、もちろん、どのような方法（例えば、細胞溶解、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）を経由して収穫されたmRNAを含むことができる。また、任意のブランドまたはRT試薬、任意の温度（マイクロミキサーの材料の許容範囲内）の種類、および任意の期間を含むことができる。例えば、我々は?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はオーストラリアの国立保健医療研究評議会（プロジェクトの助成金がない。6288480）とスコビーとクレアマッキノントラストによってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
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