Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen
Summary
M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen<em> In vivo</em>. Deze methode biedt een methode om de M-cel functie te begrijpen in het immuunsysteem.
Abstract
De binnenkant van onze darmen wordt bewoond met een enorm aantal van de commensale bacteriën. De mucosale oppervlak van het maag-darmkanaal is continu blootgesteld aan hen en af en toe aan pathogenen. De darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) spelen een belangrijke rol voor de inductie van de mucosale immuunrespons op deze microben 1, 2. Tot inleiding van de mucosale immuunrespons, moet de mucosale antigenen worden vervoerd van de darm lumen over de epitheliale barrière in georganiseerde lymfoïde follikels zoals de plaques van Peyer. Dit antigeen transcytose wordt gemedieerd door gespecialiseerde epitheliale cellen M 3, 4. M-cellen zijn atypische epitheelcellen die actief fagocyteren macromoleculen en microben. In tegenstelling tot dendritische cellen (DC's) en macrofagen, die zich richten op antigenen te lysosomen voor degradatie, M cellen voornamelijk transcytose de geïnternaliseerde antigenen. Deze krachtige macromoleculaire transcytose door M cellen levert antigeen naar de onderliggende organisatie lymfoïde follikels eend wordt verondersteld essentieel te zijn voor het initiëren antigeen-specifieke mucosale immuunrespons. Echter, de moleculaire mechanismen ter bevordering van dit antigeen opname door M-cellen zijn grotendeels onbekend. We hebben eerder gemeld dat glycoproteïne 2 (GP2), in het bijzonder uitgedrukt op de apicale plasmamembraan van de M-cellen onder de enterocyten, dient als een transcytotic receptor voor een subset van commensale en pathogene enterobacteriën, waaronder Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium ), door het herkennen FimH, een component van type I pili op het bacteriële buitenste membraan 5. Hier presenteren we een methode voor de toepassing van de pleister een muis Peyer's intestinale loop-test voor bacteriële opname te evalueren door M-cellen. Deze methode is een verbeterde versie van de muis intestinale loop test eerder beschreven 6, 7. De verbeterde punten zijn als volgt: 1. Isofluraan werd gebruikt als een anestheticum. 2. Ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusiefING Peyer's patch werd opgericht. 3. Bacteriën door M cellen genomen werden fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). 4. M-cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer's patch werden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescerende bacteriën transcytose door M-cellen werden waargenomen door confocale microscopische analyse. De muis Peyer's patch intestinale loop-test zou kunnen leveren is het antwoord wat voor soort commensale of pathogene bacteriën transcytosed door M-cellen, en kan ons naar het moleculaire mechanisme van hoe mucosale immuunsysteem te stimuleren door middel van M cellen te begrijpen leiden.
Protocol
Discussion
De incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriële suspensie wordt meestal gedurende 1 uur om de bacteriële opname te observeren in de M-cellen. In het geval van 4 uur incubatie worden de bacteriën vaak gedetecteerd in de T cel zone van de plaques van Peyer. Omdat de verdampte isofluraan inhalatie-anesthesie kon houden muizen stabiel, de incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriesuspensie is uitbreidbaar naar de bacteriën die verhuizen naar T-cel-zone in patch Peyer te observeren. Het …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag alle EIB-leden bedanken voor het ontwikkelen van deze techniek. Dit onderzoek werd mede ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden "Membrane Traffic" (HO), en de "Matrix van infectieuze Phenomena" (KH), Young Scientists (SF en KH), en Wetenschappelijk Onderzoek (HO ), en Wetenschappelijk Onderzoek over innovatieve Areas "Intracellulaire Logistics" (HO), van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB Agar Ampicillin- 100 |
SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack |
GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester |
Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus |
Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution |
BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody |
MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific |
Jackson ImmunoResearch |
112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin |
Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope |
Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope |
Applied Precision | DeltaVision Core |
Riferimenti
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer’s patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells–entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer’s patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer’s patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
