Summary

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

Published: December 17, 2011
doi:

Summary

Cellule M specializzato in un follicolo-associato epitelio che copre le placche di Peyer svolgono un ruolo importante per la immunosorveglianza mucosa intestinale in tessuto linfoide associato. Qui abbiamo descritto il metodo di valutazione per transcitosi batterica da parte delle cellule M<em> In vivo</em>. Questo metodo fornisce un metodo per capire M-funzione delle cellule del sistema immunitario.

Abstract

L'interno del nostro intestino è abitato con un numero enorme di batteri commensali. La superficie mucosa del tratto gastrointestinale è continuamente esposto a loro e, occasionalmente, agli agenti patogeni. L'intestino tessuto linfoide associato (GALT) svolgono un ruolo chiave per l'induzione della risposta immunitaria della mucosa di questi microbi 1, 2. Per iniziare la risposta immunitaria delle mucose, gli antigeni della mucosa deve essere trasportato dal lume dell'intestino attraverso la barriera epiteliale organizzato in follicoli linfoidi come le placche di Peyer. Questo transcitosi antigene è mediata da cellule specializzate M epiteliali 3, 4. Cellule M sono atipici cellule epiteliali che attivamente fagocitare macromolecole e microbi. A differenza delle cellule dendritiche (DC) e macrofagi, che gli antigeni target lisosomi per la degradazione, le cellule M principalmente transcytose gli antigeni interiorizzato. Questo transcitosi macromolecolari vigoroso attraverso le cellule M fornisce l'antigene al sottostante follicoli linfoidi organizzato unod si crede di essere indispensabile per l'avvio della mucosa risposte immunitarie antigene-specifiche. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla promozione di questo assorbimento dell'antigene da parte delle cellule M sono in gran parte sconosciuti. Abbiamo già riferito che la glicoproteina 2 (Gp2), in particolare espressi sulla membrana plasmatica apicale delle cellule M tra enterociti, serve come un recettore transcytotic per un sottoinsieme di commensale e di enterobatteri patogeni, tra cui l'Escherichia coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (S. Typhimurium ), riconoscendo FimH, un componente di tipo I pili sulla membrana batterica esterna 5. Qui vi presentiamo un metodo per l'applicazione di test patchare una Peyer mouse ad anello per valutare l'assorbimento intestinale batterica da parte delle cellule M. Questo metodo è una versione migliorata del test intestinale ciclo del mouse descritto in precedenza 6, 7. I punti migliori sono le seguenti: 1. Isoflurano è stato usato come agente anestetico. 2. Circa 1 cm legatura compresi anse intestinalipatch di ING Peyer è stato istituito. 3. I batteri captata dalle cellule M sono state marcate da reagente etichettatura fluorescenza o con iperespressione delle proteine ​​fluorescenti, come la proteina fluorescente verde (GFP). 4. Cellule M nel follicolo-associato epitelio che copre patch di Peyer sono stati rilevati in diretta integrale con montaggio immunostainig con anticorpi anti GP2. 5. Fluorescenti transcitosi batterica da parte delle cellule M sono stati osservati da analisi al microscopio confocale. La patch di Peyer mouse test ciclo intestinale potrebbe fornire la risposta che tipo di batteri patogeni o commensali transcytosed da parte delle cellule M, e può portarci a comprendere il meccanismo molecolare di come stimolare il sistema immunitario della mucosa attraverso le cellule M.

Protocol

1. Preparazione delle cellule batteriche Glicerolo Streak fornito batteri fluorescente (GFP che esprimono come S. Typhimurium) su una piastra di agar LB contenente 100 mg / ml di ampicillina. La cultura di una singola colonia da agar-agar LB durante la notte in 2 ml di terreno LB nuovo. Aggiungere 0,5 ml di coltura batterica a 4,5 ml di terreno LB ed incubare nuove fino densità ottica di 1,0 a 600 nm è raggiunto. Cellule raccolta batterica mediante centrifugazione (3.0…

Discussion

Il tempo di incubazione di patch di legatura di Peyer con sospensione batterica è di solito per 1 ora di osservare l'incorporazione batterica in cellule M. In caso di 4 ore di incubazione, i batteri sono spesso rilevate nella zona delle cellule T di placche di Peyer. Come l'anestesia vaporizzato inalanti isoflurano potrebbe mantenere stabili i topi, il tempo di incubazione della patch di Peyer legatura con sospensione batterica è estendibile a osservare i batteri che si muovono in cellule T nella zona di…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri della BEI per lo sviluppo di questa tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta in parte da Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sulle aree prioritarie "traffico di membrana" (HO), e "Matrix dei fenomeni infettive" (KH), giovani scienziati (SF e KH), e della Ricerca Scientifica (HO ), e della Ricerca Scientifica in settori innovativi "Logistica intracellulare" (HO), dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667  
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001  
Alexa Fluor 350
carboxylic acid,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168  
Inhalation anesthesia
apparatus
Shinano Seisakusho SN-487  
Fixation and
Permeabilization
Solution
BD 554722  
Anti mouse
Glycoprotein 2
antibody
MBL D278-3 200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F(ab’)2 fragment
specific
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-fold dilution
Confocal laser
scanning microscope
Leica Microsystems DMIRE2  
DeltaVision
Restoration
deconvolution
microscope
Applied Precision DeltaVision Core  

Riferimenti

  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
  3. Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
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Citazione di questo articolo
Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225, doi:10.3791/3225 (2011).

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