Utføre Custom mikroRNA Microarray Experiments

Summary

En enkel prosedyre å utføre tilpassede mikroRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinnene omfatter isolere RNA, merking RNA og referanse DNA, hybridizing prøvene til microarrays, skanning microarrays, kvantifisere og analysere hybridisering signaler.

Abstract

microRNAs (miRNAs) er en stor familie med ~ 22 nukleotider (nt) lang RNA-molekyler som er mye uttrykt i eukaryoter ^1. Komplekse genomer kode minst hundrevis av miRNAs, som primært hemmer uttrykk for et stort antall mål gener post-transcriptionally ^{2, 3.} miRNAs kontrollerer et bredt spekter av biologiske prosesser ^1. I tillegg har endret miRNA uttrykk vært forbundet med menneskelige sykdommer som kreft, og miRNAs kan tjene som biomarkører for sykdom og prognose ^{4, 5.} Det er derfor viktig å forstå uttrykk og funksjoner miRNAs under mange forskjellige forhold.

Tre store tilnærminger har vært ansatt til profilen miRNA uttrykk: real-time PCR, mikromatriser, og dype sekvensering. Teknikken av miRNA microarray har fordelen av å være high-throughput, generelt mindre kostbare, og det meste av det eksperimentelle og analyse skritt kan være CarrIED ut i en molekylærbiologisk laboratorium ved de fleste universiteter, medisinske skoler og tilhørende sykehus. Her beskriver vi en metode for å utføre tilpassede miRNA microarray eksperimenter. Et miRNA probe settet vil bli trykket på glass lysbilder å produsere miRNA mikromatriser. RNA er isolert ved hjelp av en metode eller reagens som bevarer små RNA arter, og deretter merket med fluorescens fargestoff. Som en kontroll, er referanse DNA-oligonukleotider tilsvarende en undergruppe av miRNAs også merket med en annen fluorescens fargestoff. Henvisningen DNA vil tjene til å demonstrere kvaliteten av rasgropa og hybridisering og vil også bli brukt for data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridisert til en microarray skyve inneholder prober for det meste av miRNAs i databasen. Etter vask, er lysbildet skannes å få bilder, og intensiteter av de enkelte stedene tallfestet. Disse rå signalene vil bli videre bearbeidet og analysert som uttrykk data av tilsvarende miRNAs. Microarray lysbilder kan være strippet og regenereres for å redusere kostnadene ved mikromatriser og å forbedre konsistensen av microarray eksperimenter. De samme prinsipper og prosedyrer som gjelder for andre typer tilpassede microarray eksperimenter.

Protocol

1. Trykking av tilpassede miRNA microarrays

1. Skriv ut microarray lysbilder hjelp av microarray kjernen Facility Services ved et universitet eller en bedrift. Kvaliteten på microarray fabrikasjon er en av de mest kritiske faktorene for å lykkes med en microarray eksperiment. Prøv noen tjenester dersom mulig. Ideelt sett ville man print 50-100 lysbilder om gangen, og alle lysbildene vil se identiske, med godt atskilt, individuelle flekker.
2. For microarray støtte, bruker vi de hullene II belagt lysbilder.
3. For miRNA sonder, bruker vi miRNA den NCode Multi-Species Microarray Probe Set V2.
4. Løs alle oligonukleotider i 3 x SSC ved 10 mm og quadruply skrive dem ut på lysbildene. Fix lysbildene ved ultrafiolett bestråling i henhold til instruks for GAAPS II lysbilder. Etikett lysbildet med en diamant penn for å markere området og siden med den trykte sonder. Oppbevares ved 22 ° C.

2. Prøvepreparering

1. Enhver metodeeller reagens kan brukes til å isolere RNA, så lenge den bevarer små RNAS. Vi bruker vanligvis Trizol (Invitrogen) for å trekke total RNA, med tilfredsstillende mengde og kvalitet av RNA preparater, målt ved en _260nm og A _280nm avlesninger.
2. For RNA merking, blanding ~ 25 mikrogram total RNA med 0,5 mikrogram 5'-PCU-DY547-3 ^'6 i 1 x buffer (50 mM HEPES, 7,8 pH, 20 mM MgCl _2, 10 mikrogram / ​​ml BSA, 10% DMSO) som inneholder ~ 20 enheter T4 RNA en ligase, supplert med ~ 10 mM DTT og ~ 0,02 til 0,03 siste bind av 10 x T4 RNA ligase en buffer for ATP.
3. La merking for å gå videre på is inni et kjøleskap for 2-24 timer. Bunnfallet RNA med 0,3 M natriumacetat og 3 mengder etanol. For effektiv ligation og nedbør, oppløse total RNA på over 2 mg / ml, og holde den totale ligation volum på ~ 20 mL.
   1. Hvis mindre RNA er tilgjengelig, mengden av innspill RNA og 5'-PCU-DY547-3 'kan skaleres ned. </ Li>
   2. Dersom RNA er fortynne veldig, legg transportør som gjær tRNA til hjelp i nedbør.
4. Kombiner og etiketten i totalt 1 mikrogram av referanse DNA oligonucleotides tilsvarende en undergruppe av pattedyr miRNAs bruke Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶ som en kontroll for hybridisering prosessen. Rense den merkede DNA ved hjelp av en CentriSep kolonne og lagre i mørke ved -20 ° C.

3. Microarray hybridisering

1. For å bruke lysbildene for første gang, pre-hybridize lysbildene i en filtrert løsning av 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA i 30-60 minutter ved 37 ° C. Senk dem i vann et par ganger, deretter i isopropanol. Tørk lysbilder ved hjelp av en sentrifuge med et lysbilde adapter på 100 gr i 5 min ved 22 ° C.

Merk: Vi bruker Corning mikromatriser hybridisering kamre og Erie Scientific mSeries av Lifterslips å utføre microarray hybridisering.

2. Skyll lifterslips i vann, deretter i etanol, før tørking i luft. Plasser et lysbilde i en microarray hybridisering kammer base, og en lifterslip på toppen av lysbildet. Den lifterslip vil dekke sonden området, med sine hvite striper kontakte lysbildet.
3. I mørket, spinn ned utfelte, merket RNA. Vask den gang med 70% etanol, og luft tørk pellet. Den pellet bør være rødlig.
4. Klargjør en hybridisering løsning som inneholder 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamide ⁶ med 1/15-1/100 mL av renset, merket referanse DNA (2,4) per RNA prøve. Mengden tilsatt referanse DNA avhenger av hvor mange forskjellige oligonukleotider er merket (2,4). Hvis det er over 100, så mindre fortynning er nødvendig.
5. Oppløse RNA pellet godt med ~ 60 mL av hybridisering løsningen.
6. Tilsett 20 mL vann til hver av de luftfuktingsanlegg brønnene i Corning microarray hybridisering kammer base.
7. Legg than blanding av merket RNA og referanse DNA til i lysbildet. Bruk en tynn pipette tips, forsiktig berører kanten av lifterslip, og la løsningen å gå inn i rommet mellom lifterslip og skyv gjennom sugekraft.
8. Plasser hybridisering kammeret dekke over basen, og deretter forsegle kammeret med metall klipp.
9. Sett hele kammer inne i plastposen som følger med kammer kassett fra Corning.
10. Plasser kammeret kassett (s) inne i en container med fuktet papirhåndkle; dekke beholderen med plastfolie og legg den inni en 37 ° C fuktig, cellekultur inkubator for ~ 24 timer. Disse forholdsreglene (3.6, 3.9, 3.10) sikre at hybridiseringen løsningen ikke tørke ut under inkubasjon.

Fire. Post-hybridisering prosessering

1. Demonter kammeret kassettene en etter en. Senk et lysbilde og lifterslip i 2 x SSC ved 22 ° C. Den lifterslip vil naturlig falle av lysbildet. Plasser den i 0,8 x SSC. Vasklysbildene i 0,8 x SSC to ganger, deretter tre ganger i 0,4 x SSC, 1-2 min totalt. Tørk lysbilder ved hjelp av en sentrifuge med et lysbilde adapter. Vask lifterslips med vann og lagre for gjenbruk senere.
2. Skanne lysbilder med noen passende scanner, f.eks Perkin Elmer ScanArray 5000 eller molekylære enheter Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scan på bølgelengder nær 547 nm og 647 nm for å oppnå tilsvarende bildefiler.
3. Bruk programmer som BlueFuse å kvantifisere pixel intensiteter i input, bildefiler fra 4,2). Inspiser individuelle flekker med programmet til å ekskludere unormale flekker på microarrays fra videre vurdering. Disse unormale flekker vanligvis oppstår fra fattige skyve utskrift eller skyv håndtering etter hybridisering.
4. Bruk programmer som GeneSpring og Excel for dataanalyse og presentasjon. Generelle betraktninger for microarray data normalisering gjelder, som er utenfor rammen av dette papiret.
5. Når tilfredsstillende signaler er innhentet after 4.3), stripe mikromatriser lysbilder for gjenbruk ^7. Skyll lysbildene i vann, deretter fordype i forvarmet, 1 mM NaOH og 0,1 x SSC i en flekker rett ved 62 ° C i 10-20 minutter. Gjenta inkubering gang. Vask glir et par ganger i vann i opptil 60 minutter med forsiktig risting ved 22 ° C. Tørk lysbilder ved hjelp av en sentrifuge, og oppbevar ved 22 ° C.
6. For å bruke regenererte lysbilder, er det ikke nødvendig å forhåndsbestille hybridize dem igjen. Bare vask dem i vann fulgt av isopropanol, og tørk glir rett før hybridisering.

5. Representant Resultater:

Vi har i stor grad fulgt de beskrevne prosedyrer til profilen global miRNA uttrykk i tusenvis av prøver, dvs. RNAS isolert fra sebrafisk til menneske prøven under mange forskjellige forhold. Figur 1 viser et skannet bilde av en microarray å demonstrere meget presis og sterk hybridisering signaler på lysbilde. The Pearson correlatipå koeffisienter mellom teknisk replikater av microarray hybridisering er ~ 0,99 ^7, som indikerer god reproduserbarhet.

Figur 1 Composite bilde av et skannet miRNA microarray lysbilde etter hybridisering. Røde flekker resulterte fra hybridizations av referansen DNA, grønne flekker fra DY547-merket RNA prøve, mens den gule flekker var fra hybridizations av både DNA og RNA til den samme sonder.

Discussion

Til tross for nylige fremskritt i dyp sekvensering teknologier, forblir mikromatriser en levedyktig valg for high-throughput analyser av DNA og RNA. Sammenlignet med dype sekvensering, mikroarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologi laboratoriet kan utføre de fleste av forsøkene og dataanalyse i huset, noe som gir rom for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden microarrays er trolig godt egnet til intensivt forhøre sett av gener, for eksempel, kan alle eller et delsett av transkripsjonsfaktorer i et genom eller miRNAs, og de samme prinsipper og prosedyrer som presenteres her brukes i tilpassede microarray eksperimenter for å studere gen familier foruten miRNAs. Selvfølgelig er en stor ulempe om microarrays at sekvensen informasjon må være tilgjengelig a priori. Dette er ikke et problem for de fleste protein genet familier i modell organismer, men hvor mange miRNA gener det er fortsatt uklare. Sonden setter vi har brukt ble designet basert på miRBase ⁸ 9, 10, er det tydelig at de rikeste og mest biologisk relevant pattedyr miRNAs er allerede dekket av denne probe sett.

Det er ingen store tekniske utfordringer for å utføre tilpassede microarray eksperimenter. Basert på vår erfaring, nøklene til suksess for en mikroarray eksperiment er: 1) å skaffe godt trykt lysbilder, 2) å utarbeide RNA av god kvalitet og i tilstrekkelig mengde, og 3) å riktig vaske lysbildene etter hybridisering. Trizol reagens gir typisk tilstrekkelige mengder av intakt RNA for senere studier. Likevel varierer miRNA uttrykk mellom ulike vev og cellelinjer. Under de fleste forhold, bør 20-25 mikrogram total RNA gi tilstrekkelig sterke microarray signaler når merket med ligation metoden. Mindre RNA er nødvendig for miRNA-rike prøver som hjernen regioner og nerveceller. Hvis bare 1-5 mikrogram total RNA eller mindre er tilgjengelig, andre merking metodeS kan brukes, f.eks RNA merking kits fra Invitrogen, og de er kompatible med tilpassede microarray plattform er beskrevet her. For best sammenligninger, bør man alltid etiketten minst en gjengivelse av alle kontroll og eksperimentelle prøver samtidig og hybridize dem til samme print batch av lysbilder i et enkelt eksperiment. Denne forskningen design vil redusere bidraget til differensial microarray signaler som følge av variasjoner i prøven merking og behandling og i skyv kvalitet. Henvisningen DNA (i rød sone) fungerer som en kontroll for kvaliteten på lysbildet, hybridisering og vasking. En vellykket hybridisering vil gi rene og sterke signaler i rødt. Hvis DNA-signalene er gode, men RNA signalene ikke er, så bør man problemfri skyte trinnene RNA isolering og merking. For eksempel ikke RNA har forholdet A _260nm / A _280nm mellom 1,9 og 2,1? Er pellet rødlige i 3.3?

Mesteparten av investeringenfor mikromatriser kan være for skyve utskrift og skanning. Et microarray skriver og en skanner er ofte utstyrt med kjernen anlegget ved mange universiteter og medisinske skoler. Utskrift microarrays i bulk og gjenbruk av lysbilder og lifterslips vil redusere kostnadene. Gjenbruk lysbilder har den ekstra fordelen av å forbedre konsistensen av microarray eksperimenter ^7. Vi har gjenbrukt lysbilder mer enn seks ganger og fant datakvalitet fortsatt tilfredsstillende. For å sikre best følsomhet for de mest verdifulle prøver eller prøver med minimal innspill RNA, derimot, er det likevel klokt å bruke friske lysbilder ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies