Het veranderen van de richting en oriëntatie van het elektrisch veld Tijdens elektrische pulsen Application Verbetert de Plasmide Gene Transfer In vitro</em
Summary
Gen transfectie door elektroporatie is ongeveer twee keer verbeterd wanneer oriëntatie van het elektrisch veld wordt gewijzigd tijdens de puls toepassing, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen wordt niet beïnvloed. De toename van de transfectie-gen wordt veroorzaakt door de toename van het membraan gebied dat is gemaakt bevoegd voor DNA binnenkomst in de cel.
Abstract
Gen Electroforetisch is een fysieke methode die wordt gebruikt om genen te leveren in de cellen door het toepassen van korte en intense elektrische pulsen, die destabilisatie van de celmembraan veroorzaken, waardoor het permeabel kleine moleculen en maakt de overdracht van grote moleculen, zoals DNA. Het vertegenwoordigt een alternatief voor de virale vectoren, vanwege de veiligheid, werkzaamheid en het gemak van toepassing. Voor gen Electroforetisch verschillende elektrische puls-protocollen worden gebruikt om een maximale gen transfectie te bereiken, een van hen is het elektrisch veld richting en oriëntatie te veranderen tijdens de puls levering. Wisselend elektrisch veld richting en oriëntatie verhoging van de membraan die bevoegd is voor DNA binnenkomst in de cel. In deze video, tonen we het verschil in genen Electroforetisch werkzaamheid als alle pulsen worden geleverd in dezelfde richting en wanneer pulsen worden geleverd door het veranderen van afwisselend het elektrisch veld richting en oriëntatie. Voor dit doel tip met geïntegreerde elektroden en high-voltage prototype generator, die het mogelijk maakt het veranderen van het elektrisch veld in verschillende richtingen tijdens de elektrische puls applicatie, werden gebruikt. Gene Electroforetisch werkzaamheid is bepaald 24 uur na puls toepassing als het aantal cellen die groen fluorescent eiwit verdeeld met het aantal van alle cellen. De resultaten tonen aan dat gen transfectie wordt verhoogd wanneer het elektrisch veld geaardheid in elektrische puls levering is veranderd.
Protocol
Discussion
Gen Electroforetisch is een veelzijdige biotechnologie techniek die de overdracht van DNA in cellen in staat stelt door middel van het toepassen van korte, hoge voltage elektrische pulsen 3 en staat voor een veiliger alternatief voor virale vectoren vanwege de veiligheid, werkzaamheid en het gemak van toepassing. Hoewel vandaag de dag gen Electroforetisch wordt op grote schaal gebruikt om alle typen cellen en de eerste fase I klinische studie met deze methode transfecteren is gemeld 4, zijn de onde…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Sloveense Research Agency (project J2-9770, infrastructurele centrum IP-0510 en programma P2-0249). Deze video is aanvullend materiaal voor de "Elektroporatie-based technologieën en behandelingen 'wetenschappelijke workshop en de postdoctorale opleiding, georganiseerd door de faculteit Elektrotechniek aan de Universiteit van Ljubljana, Slovenië. Auteurs danken ook Dusa Hodzic zo vriendelijk het verstrekken van plasmide DNA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
Riferimenti
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
