Cambio de la dirección y la orientación del campo eléctrico durante la aplicación pulsos eléctricos Mejora la transferencia de genes plásmido In vitro</em
Summary
Transfección de genes mediante electroporación se mejora aproximadamente dos veces en la orientación del campo eléctrico se modifica durante la aplicación de pulsos, mientras que la viabilidad celular no se ve afectada. El aumento de la transfección de genes es causada por el aumento de la superficie de membrana que se hace competente para la entrada de ADN en la célula.
Abstract
Gene electrotransferencia es un método físico utilizado para introducir genes en las células mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos, que provocan la desestabilización de la membrana celular, por lo que es permeable a pequeñas moléculas y permite la transferencia de moléculas grandes como el ADN. Representa una alternativa a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Para el gen de electrotransferencia diferentes protocolos de impulsos eléctricos se utilizan con el fin de lograr la máxima transfección de genes, uno de ellos es cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación durante la entrega de pulso. Cambio de la dirección del campo eléctrico y la orientación de aumentar la superficie de la membrana competente para la entrada de ADN en la célula. En este video, se demuestra la diferencia en la eficacia del gen electrotransferencia cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación. Para este propósito la punta con electrodos integrados y de alta tensión del generador prototipo, que permite cambiar de campo eléctrico en diferentes direcciones durante la aplicación de pulsos eléctricos, fueron utilizados. Gene eficacia electrotransferencia se determina 24 horas después de la aplicación de pulsos como el número de células que expresan la proteína verde fluorescente dividido por el número de todas las células. Los resultados muestran que la transfección de genes se incrementa cuando la orientación del campo eléctrico durante la entrega de impulsos eléctricos se cambia.
Protocol
Discussion
Gene electrotransferencia es una técnica versátil que la biotecnología permite la transferencia de ADN en las células mediante la aplicación de pulsos cortos, de alta tensión eléctrica 3 y representa una alternativa más segura a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Aunque hoy en día electrotransferencia gen es ampliamente utilizado para transfectar todos los tipos de células y la primera fase I de ensayos clínicos con este método se ha reportado 4,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia (proyecto J2-9770, IP-0510 centro de la infraestructura y el programa P2-0249). Este video representa el material complementario para la "base de electroporación, tecnologías y tratamientos" taller científico y postgrado, organizado por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia. Los autores agradecen también Dusa Hodzic por la amabilidad de proporcionar el ADN del plásmido.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
Riferimenti
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
