الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية
Summary
الأسلوب المعروضة هنا تشمل إصابة الأجنة الزرد دقيقة حية مع نبضات الليزر عالية الطاقة وتحليل لاحقة من هذه الإصابات والشفاء مع مرور الوقت. نعرض أيضا كيف وصفت واحدة أو وراثيا يمكن تتبع مجموعات من خلايا عضلات الهيكل العظمي أثناء وبعد ضوء الليزر التي يسببها الضرر.
Abstract
وقد استخدمت أساليب مختلفة في الماوس التجريبية للحث على اصابة في العضلات وذلك بهدف دراسة تجديد العضلات، بما في ذلك الحقن myotoxin (بوبيفاكايين، cardiotoxin أو notexin)، زرع العضلات (إزالة التعصيب-الناجم عن إزالة التوعية التجديد)، وممارسة مكثفة، ولكن أيضا نماذج الفئران ضمور العضلات مثل الماوس MDX (لمراجعة هذه المناهج انظر 1). في الزرد، والنهج الوراثية تشمل المسوخ التي تظهر الظواهر ضمور العضلات (مثل runzel 2 أو sapje 3) ومضاد morpholinos قليل النوكليوتيد التي تمنع التعبير عن الجينات المرتبطة ضمور 4. الى جانب ذلك، النهج الكيميائية من الممكن أيضا، على سبيل المثال مع Galanthamine، وهو مركب كيميائي تثبيط أستيل، مما يؤدي إلى hypercontraction، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى ضمور العضلات 5. ومع ذلك، والدوائية الجينية النهج زتؤثر enerally جميع العضلات داخل الفرد، في حين أن أكثر سهولة التحكم في مدى الجروح التي أصيب بها جسديا مكانيا وزمانيا 1. الإصابة البدنية المترجمة يسمح بتقييم العضلات المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. في الواقع، كنا مؤخرا بوساطة الليزر التذرية لدراسة الهيكل العظمي خلايا العضلات التجدد في الجنين الزرد 6، بينما مجموعة أخرى ذكرت مؤخرا استخدام ليزر ثنائي الفوتون (822 نانومتر) على الضرر محليا جدا غشاء البلازما من العضلات الفردية الزرد الجنينية الخلايا 7.
هنا، ونحن التقرير وسيلة لاستخدام الليزر micropoint (أندور التكنولوجيا) لإصابة العضلات الهيكلية خلية في الجنين الزرد. الليزر هو ليزر micropoint الطاقة العالية الذي هو مناسبة لاجتثاث الخلايا المستهدفة في طول موجة من 435 نانومتر. توصيل الليزر لمجهر (في الإعداد لدينا، المجهر الضوئي من زايس) في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن تستخدم المجهر في نفس الوقت وأو التركيز ضوء الليزر على العينة وتصور لآثار اصابة (brightfield أو مضان). المعلمات من أجل السيطرة على نبضات الليزر الطول الموجي وتشمل، وكثافة، وعدد النبضات.
نظرا لشفافيتها والتطور الجنيني الخارجية، والجنين هو الزرد قابلة للغاية لإصابة الليزر التي يسببها كل من والانتعاش لدراسة لاحقة. بين 1 و 2 أيام بعد الإخصاب، somitic خلايا عضلات الهيكل العظمي الخضوع تدريجيا من النضج الخلفي سابقة لنظرا لتطور somitogenesis من الجذع إلى ذيل 8 و 9. في هذه المراحل، نشل الأجنة تلقائيا وبدء السباحة. تم مؤخرا التعرف على الزرد الفقاريات كائن حي نموذجا هاما لدراسة وترميم الأنسجة، وأنواع عديدة من الأنسجة (القلب، العصبية، الأوعية الدموية وغيرها) يمكن تجديدها بعد الإصابة في الزرد الكبار 10 و 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الليزر بوساطة الإصابة هو وسيلة قوية لإلحاق جروح من الحجم المطلوب من قبل ablating الخلايا من أجل دراسة تجديد تحت ظروف محكومة في الجنين الزرد. خاصة، ويمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا (الشكل 2) ويمكن التحكم كل من منطقة الإصابة وكذلك التوقيت. وبعد ذلك، يتم رصدها ب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بوب نوفاك (أندور التكنولوجيا) للمساعدة التقنية والمشورة. SA-S. معتمد من قبل زمالة هايزنبرغ للجمعية الألمانية للبحوث (DFG). وأيد هذا العمل من قبل DFG منحة SE2016/7-1.
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
Riferimenti
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
