Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Summary

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Abstract

Diversi approcci sperimentali sono stati utilizzati nel topo per indurre infortunio muscolare, con l'obiettivo di studiare la rigenerazione muscolare, compresi gli apporti myotoxin (bupivacaina, cardiotossina o notexin), trapianti muscolari (denervazione-devascolarizzazione rigenerazione indotta), esercizio fisico intenso, ma anche modelli murini distrofia muscolare come ad esempio il topo mdx (per una rassegna di questi approcci vedi ^1). In zebrafish, approcci genetici includono mutanti che presentano fenotipi distrofia muscolare (come runzel ² o sapje ³⁾ e antisenso Morpholinos oligonucleotide che bloccano l'espressione di geni associati alla distrofia ^4. Inoltre, approcci chimici sono possibili, per esempio con Galanthamine, un composto chimico inibente acetilcolinesterasi, ottenendo in tal modo ipercontrazione, che finisce per distrofia muscolare ^5. Approcci tuttavia, genetici e farmacologici generally colpire tutti i muscoli all'interno di un individuo, mentre l'entità delle ferite inferte fisicamente sono più facilmente controllabili spazialmente e temporalmente ^1. Localizzata lesioni consente la valutazione del muscolo controlaterale come controllo interno. Infatti, abbiamo recentemente utilizzato ablazione laser-mediata delle cellule per studiare la rigenerazione del muscolo scheletrico nel zebrafish ^6, mentre un altro gruppo ha recentemente riportato l'uso di un laser a due fotoni (822 nm) per danneggiare molto localmente la membrana plasmatica di singoli muscoli zebrafish embrionale celle ^7.

Qui, si riporta un metodo per utilizzare il laser Micropoint (Andor Technology) per lesioni cellula muscolare scheletrica in zebrafish. Il laser Micropoint è un laser ad alta energia che è adatto per l'ablazione cellula bersaglio alla lunghezza d'onda di 435 nm. Il laser viene collegato ad un microscopio (nel nostro setup, un microscopio ottico Zeiss da) in modo tale che il microscopio può essere utilizzato al tempo stesso fo focalizzare la luce laser sul campione e per visualizzare gli effetti della ferita (campo chiaro o fluorescenza). I parametri per controllare gli impulsi laser comprendono lunghezza d'onda, intensità e numero di impulsi.

Grazie alla sua trasparenza ed esterna sviluppo embrionale, l'embrione di zebrafish è altamente suscettibile sia indotta da laser pregiudizio e per lo studio del successivo recupero. Tra 1 e 2 giorni dopo la fecondazione, somitic cellule muscolari scheletriche progressivamente maturano da anteriore a posteriore a causa della progressione della somitogenesis dal tronco alla coda ^{8, 9.} In queste fasi, embrioni spontaneamente twitch e avviare il nuoto. Il pesce zebra è stata recentemente riconosciuta come un importante organismo modello vertebrato per lo studio della rigenerazione dei tessuti, come molti tipi di tessuti (cardiache, neuronale, vascolare ecc) possono essere rigenerati dopo lesione nell'adulto zebrafish ^{10, 11.}

Protocol

1. Etichettatura singole cellule Iniettare unicellulari embrioni allo stadio con un plasmide codificante GFP o qualsiasi proteina di fusione GFP sotto il controllo di un promotore di β-actina. Durante lo sviluppo, GFP è quindi espresso in modo mosaico. Qui, abbiamo usato il costrutto transgenico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], che pone l'α-actinina-proteina di fusione GFP sotto il controllo del promotore di β-actina. 2. Embrione Embedding <…

Representative Results

Lesioni laser-mediata è stata eseguita su immobilizzati 1 giorno di età embrioni. Come mostrato in figura 1, un paio di impulsi laser può generare una ferita piccola, facilmente riconoscibili dai danneggiati, arrotolati, Actina ricchi miofibrille che sono normalmente tese tra i confini somite. Un più alto numero di impulsi laser sarà comunque comportare un blocco somite massicciamente danneggiato, dove vengono distrutti maggior miofibrille. Tuttavia, si può osservare che letteralmente "il tem…

Discussion

Laser-mediata lesione è un metodo efficace per infliggere ferite della dimensione desiderata da ablazione cellule per studiare la rigenerazione in condizioni controllate in zebrafish. In particolare, le cellule possono essere mirati proprio (Figura 2) e sia l'area ferita e tempi può essere controllato. Successivamente, il sito di lesione e processi di rigenerazione sono facilmente controllati, registrati (Figura 3) e analizzati (Figura 1). Tuttavia, anche se il la…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)