Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Summary

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Abstract

Varios enfoques experimentales se han utilizado en ratón para inducir lesión muscular con el objetivo de estudiar la regeneración muscular, incluyendo inyecciones myotoxin (bupivacaína, cardiotoxina o notexin), trasplantes musculares (denervación-desvascularización regeneración inducida), el ejercicio intenso, sino también modelos murinos de distrofia muscular como el ratón mdx (para una revisión de estos enfoques ver ^1). En el pez cebra, los enfoques genéticos incluyen mutantes que exhiben fenotipos de distrofia muscular (como runzel ² o sapje ³⁾ y antisentido morfolinos de oligonucleótidos que bloquean la expresión de genes asociados a la distrofia ^4. Además, los enfoques químicos también son posibles, por ejemplo, con la galantamina, un compuesto químico inhibiendo la acetilcolinesterasa, resultando así en hipercontracción, que finalmente conduce a la distrofia muscular ^5. Sin embargo, los enfoques genéticos y farmacológicos generalmente afectar a todos los músculos dentro de un individuo, mientras que la extensión de las lesiones infligidas físicamente son más fácilmente controlados espacial y temporalmente ^1. Lesión física localizada permite la evaluación de músculo contralateral como control interno. De hecho, recientemente hemos utilizado láser mediada por ablación celular para estudiar la regeneración del músculo esquelético en el embrión de pez cebra ^6, mientras que otro grupo informó recientemente el uso de un láser de dos fotones (822 nm) a dañar muy localmente la membrana plasmática de músculo individual embrionario de pez cebra células ^7.

Aquí, se presenta un método para utilizar el láser micropoint (Andor Technology) para lesión celular del músculo esquelético en el embrión de pez cebra. El láser micropoint es un láser de alta energía, que es adecuado para la ablación de células reconocidas en una longitud de onda de 435 nm. El láser está conectado a un microscopio (en nuestra configuración, un microscopio óptico de Zeiss) de tal manera que el microscopio se puede utilizar en el mismo tiempo fo enfocar la luz láser sobre la muestra y para la visualización de los efectos de la herida (campo claro o fluorescencia). Los parámetros para el control de pulsos de láser incluyen longitud de onda, intensidad, y número de pulsos.

Debido a su transparencia y el desarrollo embrionario externo, el embrión de pez cebra es altamente susceptible, tanto para la lesión inducida por láser y para el estudio de la recuperación posterior. Entre 1 y 2 días después de la fecundación, las células del músculo esquelético somitic someterse a la maduración progresiva de anterior a posterior debido a la progresión de somitogenesis desde el tronco hasta la cola ^{8, 9.} En estas etapas, los embriones espontáneamente crispar e iniciar la natación. El pez cebra se ha reconocido recientemente como un organismo vertebrado importante modelo para el estudio de la regeneración de los tejidos, como muchos tipos de tejidos (cardiacas, neuronal, vascular, etc) se puede regenerar después de la lesión en el adulto pez cebra ^{10, 11.}

Protocol

1. Etiquetado de células individuales Inyectar una célula de embriones etapa con un plásmido que codifica GFP o cualquier proteína GFP-fusión bajo el control de un promotor de β-actina. Durante el desarrollo, la GFP se expresa entonces en forma de mosaicos. Aquí, se utilizó el constructo transgénico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], que coloca la proteína de fusión α-actinina-GFP bajo el control del promotor de la β-actina. 2. Embriones …

Representative Results

Laser lesión mediada se realizó en inmovilizadas 1 día de edad embriones. Como se muestra en la Figura 1, un láser de pulsos pocos puede generar una pequeña herida, fácilmente reconocible por los dañados, enrollados, actina ricos en miofibrillas que normalmente se extendía entre los límites somite. Un mayor número de pulsos de láser sin embargo resultará en un bloque de somite dañado masivamente, en donde la mayoría de las miofibrillas son destruidos. No obstante, se puede observar que, li…

Discussion

Laser lesión mediada es un método poderoso para infligir heridas de un tamaño deseado mediante la ablación de las células con el fin de estudiar la regeneración bajo condiciones controladas en el embrión de pez cebra. En particular, las células pueden ser dirigidos con precisión (Figura 2) y tanto el área de la lesión así como de temporización puede ser controlada. Posteriormente, el sitio de la lesión y los procesos de regeneración son fácilmente controlados, registrados (Figura…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)