激光伤害的斑马鱼胚胎骨骼肌
Summary
这里介绍的方法，包括精确的具有高能量的激光脉冲和随后的分析随时间的伤害和其恢复损伤的活斑马鱼胚胎。我们还展示了如何转基因标记的单或骨骼肌细胞可以被跟踪和激光损伤后。
Abstract
不同的实验方法，使用鼠标的目的是研究肌肉再生，的包括myotoxin注射（布比卡因，心脏毒素或notexin），，，肌肉移植（神经损伤周围血管离断术诱导再生），大强度运动引起肌肉损伤，但也小鼠的肌营养不良症模型如评论这些方法mdx小鼠（参见图1）。在斑马鱼基因的方法包括突变体，表现出肌营养不良症的表型（，如runzel 2或sapje 3）和反义寡核苷酸吗啉代，阻止营养不良相关基因的表达。此外，化学方法，也有可能， 例如 ，加兰他敏，一种化学化合物抑制乙酰胆碱酯酶，从而导致hypercontraction，最终导致肌营养不良症5。然而，遗传学和药理学方法克enerally影响个人所有的肌肉内，而身体造成伤害的程度，更容易控制时间和空间上1。本地化的人身伤害可以作为内部控制的评估对侧肌肉。事实上，我们最近用激光消融介导的细胞研究在斑马鱼胚胎6骨骼肌再生，而另一组最近报道了利用双光子激光（822 nm）的损害本地个别胚胎斑马鱼肌肉的细胞膜细胞7。
在这里，我们报告使用微点激光（安道尔的技术）在斑马鱼胚胎骨骼肌细胞损伤的方法。微点激光是一种高能量的激光，这是适合于在波长为435nm的靶细胞消融。的激光以这样的方式被连接到显微镜（在我们的设置，光学显微镜从蔡司）显微镜，可以使用在同一时间f或聚焦在样品上的激光和用于可视化的伤人（明或荧光）的影响。用于控制激光脉冲的参数包括波长，强度和脉冲数。
由于其透明度和外部的胚胎发育，斑马鱼胚胎的研究为激光损伤和随后的复苏是非常适合的。受精后1至2天，体节骨骼肌细胞逐渐接受由前向后成熟体节发育的进展，从树干尾8，9。在这些阶段，胚胎自发地抽搐，并开始游泳。最近斑马鱼已被确认为一个重要的脊椎动物模式生物组织再生的研究，许多类型的组织（心脏，神经，血管等）损伤的成年斑马鱼10，11后是可以再生的。
Protocol
Representative Results
Discussion
激光介导的损伤是造成所需大小的伤口，切除细胞，以研究在受控条件下的斑马鱼胚胎再生一个功能强大的方法。值得注意的是，细胞可以有针对性的精确（ 图2），可以控制损伤区以及定时。随后，上述损伤部位和再生过程很容易监测，记录（ 图3），并进行分析（ 图1）。然而，虽然激光以及集中在x-和y-轴，它不能完全集中在z-轴。这可能会导致损坏位于?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢鲍勃·诺瓦克（安道尔的技术）的技术帮助和建议。 SA-S。的德意志研究联合会（DFG）的海森堡奖学金的支持。这项工作是支持，DFG授予SE2016/7-1。
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
Riferimenti
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
