Summary
Photoacoustique ophtalmologie (PAOM), une modalité d'imagerie optique basée sur l'absorption, fournit l'évaluation complémentaire de la rétine aux technologies actuellement disponibles imagerie ophtalmique. Nous rapportons l'aide de PAOM intégré domaine spectral tomographie par cohérence optique (SD-OCT) pour une utilisation simultanée imagerie rétinienne chez le rat multimodal.
Abstract
Tant le diagnostic clinique et fondamentale enquête des maladies oculaires majeurs grandement bénéficier de diverses technologies non invasives d'imagerie ophtalmique. Existants modalités d'imagerie de la rétine, comme la photographie de fundus 1, ophtalmoscopie confocale à balayage laser (ALSC) 2, et la tomographie par cohérence optique (OCT) 3, ont des contributions importantes à la surveillance des maladies et des progressions onsets, et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, elles principalement s'appuyer sur les sauvegardes reflètent photons de la rétine. En conséquence, les propriétés d'absorption optique de la rétine, qui sont généralement fortement liés au statut de la physiopathologie de la rétine, sont inaccessibles par les techniques d'imagerie traditionnelles.
Ophtalmoscopie photoacoustique (PAOM) est une modalité d'imagerie rétinienne émergente qui permet la détection des contrastes d'absorption optique de l'œil avec une grande sensibilité 4-7. En PAOM nanosecond impulsions laser sont livrés à travers la pupille et balayé à travers l'oeil postérieur à induire photoacoustique (PA), des signaux qui sont détectés par un capteur ultrasonore non focalisé attaché à la paupière. En raison de la forte absorption optique de l'hémoglobine et la mélanine, PAOM est capable de façon non invasive d'imagerie les vascularisations la rétine et de la choroïde et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) mélanine à forts contrastes 6,7. Plus important encore, sur la base du bien développé spectroscopique photoacoustique imagerie 5,8, PAOM a le potentiel pour cartographier la saturation en oxygène dans l'hémoglobine des vaisseaux rétiniens, qui peut être critique dans l'étude de la physiologie et la pathologie de plusieurs maladies cécitantes 9 telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge.
En outre, étant le seul existant absorption optique à base de modalité d'imagerie ophtalmique, PAOM peut être intégré avec bien établie clinique ophtalmique imagerie techniques pour obtenir plus d'évaluations complètes anatomiques et fonctionnelles de l'oeil basée sur de multiples contrastes optiques 6,10. Dans ce travail, nous intégrons PAOM et domaine spectral OCT (SD-OCT) pour simultanément dans l'imagerie rétinienne in vivo de rat, où à la fois l'absorption optique et des propriétés de diffusion de la rétine sont révélés. La configuration du système du système d'alignement, et l'acquisition d'imagerie sont présentés.
Protocol
1. Configuration du système
- PAOM sous-système
- Source d'éclairage: un laser Nd: YAG (SPOT-10-100, Elforlight Ltd, UK: 20 pJ / impulsion, 2 ns la durée d'impulsion, 30 kHz maximum le taux de répétition des impulsions).
- La sortie du laser à 1064 nm est doublée en fréquence à 532 nm par un bêta-borate de baryum (BBO) cristal (Castech, San Jose, CA). Après scission en outre par un miroir ligne laser, 532 nm de lumière est fournie par une fibre optique monomode (P1-460A-CF-5, Thorlabs), et 1064 nm laser est enregistrée par une photodiode (DET10A, Thorlabs), qui déclenche l'acquisition du signal PA.
- La lumière laser sortant de la fibre optique monomode est fournie sur la rétine par un galvanomètre (GM, QS-7, Nutfield Technology) et une configuration de télescope (f1 = f2 et 75 mm = 14 mm, Edmund Optics) 6.
- Un transducteur aiguille floue (40-MHz de fréquence centrale, à 16 MHz de bande passante, de 0,4 x 0,4 mm 2 taille de l'élément actif, NIH ressources Center pour les technologies de transducteur à ultrasons, The University of Southern California) est mis en contact avec la paupière pour détecter les signaux générés PA de la rétine. Gel à ultrasons (Sonotech) est appliquée entre la pointe de sonde et de la paupière pour animaux bon couplage acoustique.
- Le signal PA est amplifié par deux amplificateurs (ZFL-500LN +, mini-circuits, et 5073PR, Olympus), et est numérisé par une carte d'acquisition de données (CS14200, Gage Applied).
- SD-OCT-système
- Faible source de lumière cohérence: une large bande super-luminescente diode (IPSDD0804, InPhenix; longueur d'onde centrale: 840 nm; 6-dB Largeur de bande: 50 nm), ce qui détermine la résolution axiale de 6 pm.
- La lumière dans le proche infrarouge est divisé pour référencer le bras et le bras d'un échantillon de 50 x 50 coupleur personnalisée fibre monomode (optique OZ).
- Après avoir combiné avec PAOM lumière d'éclairage par un miroir chaud (FM02, Thorlabs), le bras échantillon octobre partage la même analyse et la livraison wi optiquee PAOM 6.
- Un spectromètre de fabrication artisanale est utilisé pour enregistrer les signaux parasites SD-OCT, où une ligne de balayage CCD (Aviiva SM2, e2v) permet un taux d'A-ligne de 24 kHz. Conception des spectromètres typiques peuvent être trouvées à partir de plusieurs littératures publiées antérieurement 11 et couplé par fibre SD-OCT spectromètres sont maintenant disponibles dans le commerce. La sensibilité SD-OCT est mesuré à plus de 90 dB.
- Numérisation Scheme
- 2-D rapide balayage de trame du galvanomètre est commandé par une carte de sortie analogique (PCI-6731, National Instruments), ce qui déclenche également la fois la mise à feu laser PAOM et l'acquisition du signal de spectromètre octobre. En conséquence, les acquisitions de données dans PAOM et sous-systèmes sont synchronisés octobre.
- L'acquisition PAOM données est déclenchée par un enregistrement photodiode PAOM séquence laser (voir 1.1.2).
- Images 3-D volumétriques ou 2-D des images du fond d'œil sont construits à partir de 256 B-scan images (256 lignes A par B-Analyser l'image).
2. Système d'alignement
- Maximiser l'efficacité de doublage de fréquence du cristal BBO et l'efficacité de couplage de la fibre optique monomode. Porter des lunettes de protection (LG3 Thorlabs) pour protéger les yeux du personnel lors de l'optimisation de la lumière PAOM éclairante.
- Collimater la sortie laser à fibre de PAOM 2,0 mm de diamètre.
- Alignez les feux d'éclairage combinées de PAOM et SD-OCT à être coaxial.
- Réglez la lumière d'excitation PAOM à ~ 40 nJ / impulsion et SD-OCT sonder la lumière à ~ 0,8 mW, qui sont tous deux rapporté danger pour les yeux 6,12.
3. L'imagerie in vivo rétine multimodal
- Transférer le rat à une boîte de polypropylène transparent, et l'animal anesthésié par un mélange d'air isoflurane (Phoenix pharmaceutique, Inc) et la normale à la concentration de 1,5% et un débit de 2,0 litre / min pendant 10 min.
- Retenez le rat anesthésié dans un homemade support avec cinq axes liberté réglable (figure 1), et maintenir sa température corporelle à ~ 37 ° C par un coussin chauffant (Repti Therm, les laboratoires Zoomed, Inc.) Maintenir l'anesthésie par inhalation de gaz de l'air et de l'isoflurane mixte normal avec une concentration de 1,0% et 1,5 litre / min de débit tout au long de l'expérience.
- Couper le cil en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux, dilater les pupilles avec une solution ophtalmique Tropicamide 1%, et de paralyser le muscle sphincter de l'iris en utilisant 0,5% de solution ophtalmique de chlorhydrate de tétracaïne. Appliquer des larmes artificielles (Systane, Alcon Laboratories, Inc) pour l'oeil de rat à chaque instant pour éviter la déshydratation cornée et la formation de cataracte. Surveiller le rythme cardiaque des animaux, la respiration et l'oxygénation du sang par un oxymètre de pouls (8.600 V, Nonin Medical, MN) lors de l'imagerie.
- Allumez le SD-OCT lumière d'éclairage et de vérifier la lumière de sondage à ~ 0,8 mW.
- Activer le balayage galvanomètre. Aligner la livraison SD-OCT irradiation lumineusesur la rétine de rat et d'identifier la région rétinienne d'intérêt (ROI) en ajustant le détenteur des animaux à cinq axes. Ici, le disque optique est volontairement placé dans le centre du champ de vision, tandis que le retour sur investissement doit être choisi en fonction des besoins de recherche différents.
- En outre d'ajuster le support de l'animal à optimiser les qualités SD-OCT imagerie rétinienne de section dans les deux directions de balayage (par commutation de la direction de balayage de trame) jusqu'à ce que la meilleure mise au point optique est atteint.
- Préparer le transducteur aiguille sur une plate-forme de cinq axes réglable, appliquer une goutte de gel à ultrasons à l'extrémité du capteur et douces au contact de la pointe de transducteur sur la paupière animal.
- Définir laser PAOM au mode de déclenchement externe, démarrer le balayage à galvanomètre, et activer l'affichage en temps réel de PAOM de section transversale sur l'image de la rétine animal. Réglez soigneusement le orientation de la sonde jusqu'à ce que l'image PAOM a le meilleur rapport signal sur bruit (SNR) et, dans l'intervalle, montre un uniforme distributed modèles d'amplitude PA dans les deux directions de balayage.
- Définissez les paramètres de numérisation, et de mener l'imagerie simultanée de la rétine SD-OCT et PAOM. Reconstruire les images tridimensionnelles de SD-OCT et PAOM hors ligne. Nos codes de reconstruction ont été écrit en Matlab et visualisation en trois dimensions a été réalisée nuer un freeware (Volview, Kitware). L'algorithme de reconstruction SD-OCT peut être trouvée dans la référence. 11 et l'algorithme de reconstruction PAOM peuvent être trouvées dans la référence. 6 et Réf. 13. Si nécessaire, répétez la procédure de 3,7) -3,9).
- Après l'expérience, éteindre la lumière SD-OCT sondage, enlever l'animal de support immédiatement, et le garder au chaud jusqu'à ce qu'il se réveille naturellement. Garder l'animal dans un environnement sombre pendant une heure supplémentaire pour les yeux pour récupérer. Toute la durée expérimental, y compris l'anesthésie des animaux et de l'acquisition d'image, est inférieure à 30 min pour un opérateur expérimenté.
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Representative Results
La figure 2 montre les images 2-D du fond d'œil de SD-OCT et PAOM acquises simultanément chez un rat albinos (A et B) et un rat pigmenté (C et D), respectivement. Dans les images rétiniennes SD-OCT (Figures 2A et 2C), vaisseaux rétiniens ont une apparence sombre à cause de l'absorption d'hémoglobine de sondant la lumière. En plus des vaisseaux rétiniens (RV dans la figure 2B), PAOM visualise les vascularisations choroïdiens (CV dans la figure 2B) dans l'oeil albinos en raison de la mélanine RPE défaut. Parce que l'œil pigmenté a haute concentration de mélanine, PAOM images EPR (figure 2D) avec un contraste élevé, en plus des vaisseaux rétiniens. Dans toute l'imagerie de la rétine, l'angle de balayage maximale est de 26 degrés et l'acquisition d'imagerie prend ~ 2,7 sec. Pour démontrer la capacité d'imagerie tridimensionnelle de PAOM, un rendu volumétrique des données présentées dans la figure 2b est donnée dans Figure 3.
Figure 1. Photographie du titulaire des animaux à cinq axes. Les flèches 1-5 en évidence les cinq libertés réglables et la flèche 6 souligne l'restrainer animal.
Figure 2. Simultanément acquis SD-OCT (A et C) et PAOM (B et D) des images du fond d'œil. A) et B) sont acquises à partir d'un rat albinos, et C) et D) sont acquises à partir d'un rat pigmenté. RV: des vaisseaux rétiniens, CV: vaisseau choroïdien; EPR: l'épithélium pigmentaire de la rétine. Bar: 500 um.
<strong> Figure 3. visualisation volumétrique de PAOM dans une rétine de rat albinos.
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Discussion
Ici, nous présentons une instruction détaillée sur la simultanée en imagerie rétinienne in vivo des yeux de rat en utilisant PAOM combiné avec SD-OCT. Optique de diffusion basée sur SD-OCT est, peut-être, le «gold standard» clinique de l'imagerie rétinienne 3, mais il n'est pas sensible pour détecter l'absorption optique dans la rétine. Le PAOM nouvellement développé est le seul absorption optique à base de modalité d'imagerie ophtalmique qui fournit des propriétés d'absorption optique de la rétine 6. Parce que l'hémoglobine et la mélanine sont endogènes fortes optiques pigments absorbant, PAOM permet à l'enquête de l'anatomie et les fonctions des vaisseaux rétiniens / choroïde et de la RPE sans recourir à des agents de contraste supplémentaires.
En PAOM, le transducteur ultrasonore non focalisé a une région de sensibilité limitée (~ 2,8 × 2,8 mm 2) 10 en raison de son élément de connexion fini, ce qui provoque une sensibilité de détection de signaux pourri PA vers til périphérie du champ de vision (FOV). Ainsi, l'angle d'inclinaison de la sonde doit être soigneusement ajustée pour obtenir un champ de vision homogène de la rétine. Une substitution possible pour le transducteur piézo-électrique traditionnelle consiste à appliquer des micro-résonateur en anneau, qui a des valeurs plus faibles de bruit équivalents de pression et de directivité plus large de détection 14, qui peut fournir une image plus homogène de la rétine avec un meilleur SNR PAOM. En comparant avec SD-OCT, PAOM a même résolution latérale (~ 20 mm), mais bien pire résolution axiale (~ 23 um) en raison de la bande passante actuellement limitée à ultrasons 6. La résolution axiale de PAOM peut potentiellement être améliorée en utilisant un détecteur à ultrasons roman aussi. Procédé d'étalonnage de résolutions PAOM a été signalé précédemment 6,15.
En résumé, le système intégré PAOM et SD-OCT système d'imagerie anatomique offre plus complète et l'évaluation fonctionnelle de la rétine, et, par conséquent, détient de grandes promesses dansle diagnostic clinique futur et les directions de nombreux troubles oculaires.
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Disclosures
Toutes les procédures expérimentales chez l'animal ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Northwestern University.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le généreux soutien de la National Science Foundation (CARRIÈRE CBET-1055379) et le National Institutes of Health (1RC4EY021357, 1R01EY019951). Nous reconnaissons aussi le soutien du Conseil des bourses de Chine à Song Wei.
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