Integrert Photoacoustic ophthalmoscopy og Spectral-domene optisk koherens tomografi

Summary

Photoacoustic oftalmologi (PAOM), en optisk-absorpsjon-basert bildebehandling modalitet gir utfyllende evaluering av netthinnen til de tilgjengelige ophthalmica imaging teknologi. Vi rapporterer bruk av PAOM integrert med spektral-domene optisk koherens tomografi (SD-OCT) for samtidig multimodal retinal bildebehandling i rotter.

Abstract

Både klinisk diagnose og grunnleggende undersøkelse av store okulære sykdommer stor nytte av ulike ikke-invasive ophthalmica imaging teknologi. Eksisterende retinal bildediagnostikk, for eksempel fundus ^en fotografering, confocal skanning laser ophthalmoscopy (cSLO) ^2, og optisk koherens tomografi (OCT) ^3, har betydelige bidrag i overvåkingen sykdom sykdomsangrep og progresjoner, og utvikle nye terapeutiske strategier. Men de hovedsakelig stole på back-reflekterte fotoner fra netthinnen. Som en konsekvens, de optiske absorpsjonsegenskaper av netthinnen, som vanligvis sterkt assosiert med retinal patofysiologien status, er utilgjengelige med de tradisjonelle imaging teknologi.

Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) er en ny retinal imaging modalitet som tillater påvisning av de optiske absorpsjon kontraster i øyet med en høy følsomhet ^4-7. I PAOM nanosecond laserpulser leveres gjennom pupillen og skannet over bakre øyet å indusere photoacoustic (PA) signaler som registreres av en ufokusert ultralyd svinger på øyelokket. På grunn av den sterke optisk absorpsjon av hemoglobin og melanin er PAOM stand til ikke-invasiv avbildning netthinnens og koroidal vasculatures og retinalt pigmentepitel (RPE) melanin ved høye kontraster ^6,7. Enda viktigere, basert på den velutviklede spektroskopiske photoacoustic bildebehandling ^5,8, har PAOM potensial til å kartlegge hemoglobin oksygenmetning i retinale blodkar, noe som kan være avgjørende i å studere fysiologi og patologi av flere blindende sykdommer ⁹ som diabetisk retinopati og neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon.

Videre er det eneste eksisterende optisk absorpsjon-baserte ophthalmic imaging modalitet, kan PAOM bli integrert med godt etablert klinisk ophthalmic bildebehandling techniques å oppnå mer omfattende anatomiske og funksjonelle evalueringer av øyet basert på flere optiske kontraster ^6,10. I dette arbeidet, integrerer vi PAOM og spektral-domene OCT (SD-OCT) for samtidig in vivo retinal avbildning av rotte, hvor både optisk absorpsjon og spredning egenskaper netthinnen blir avslørt. Systemkonfigurasjon, system justering og bildebehandling oppkjøpet blir presentert.

Protocol

1. Systemkonfigurasjon

1. PAOM Subsystem
   1. Belysning kilde: en Nd: YAG laser (SPOT-10-100, Elforlight Ltd, UK: 20 μJ / puls, 2 EFF pulsvarighet, 30 kHz er maksimal puls etter hverandre).
   2. Utgangen laser på 1064 nm er frekvens-doblet til 532 nm med en beta-barium-borat (BBO) krystall (Castech, San Jose, CA). Etter ytterligere delt av en laserlinje speil, er 532 nm lys levert gjennom en single-mode optisk fiber (P1-460A-FC-5, Thorlabs), og 1064 nm laser er registrert av en fotodiode (DET10A, Thorlabs), noe som utløser PA signal oppkjøpet.
   3. Laserlyset som kommer ut av den enkelt-modus optisk fiber er levert på netthinnen ved et galvanometer (GM, QS-7, Nutfield Technology) og et teleskop konfigurasjon (f1 = 75 mm og f2 = 14 mm, Edmund Optics) ^6.
   4. En ufokusert nål svinger (40-MHz sentrale frekvens, 16-MHz båndbredde, 0,4 × 0,4 mm ² aktive elementet størrelse, NIH Resource Center for ultralyd transducer Technologies, University of Southern California) er plassert i kontakt med øyelokket for å oppdage PA signaler generert fra netthinnen. Ultrasonic gel (Sonotech) påføres mellom svingeren spissen og animalsk øyelokk for god akustisk kobling.
   5. PA signalet forsterkes av to forsterkere (ZFL-500LN +, Mini-kretser, og 5073PR, Olympus), og blir digitalisert av en datainnsamlingsanordning bord (CS14200, Gage Applied).
2. SD-OCT Subsystem
   1. Lav sammenheng lyskilde: en bredbånd super-selvlysende diode (IPSDD0804, InPhenix, senterbølgelengde: 840 nm; 6-dB båndbredde: 50 nm), som bestemmer aksial oppløsning på 6 pm.
   2. Den nær infrarødt lys er delt å referere arm og prøve armen av en 50 × 50 tilpasset single-modus fiber coupler (OZ Optics).
   3. Etter å kombinere med PAOM opplysende lys av en varm speil (FM02, Thorlabs), deler oktober sample arm samme skanning og levering optikk with PAOM ^6.
   4. En hjemme-bygget spektrometer brukes til å registrere SD-okt forstyrrelser signaler, hvor en linje skanning CCD-kamera (Aviiva SM2, E2V) sørger for en A-line på 24 kHz. Design av typiske spektrometre kan bli funnet fra flere tidligere publiserte litteratur ¹¹ og fiber-coupled SD-Oct spektrometre er nå kommersielt tilgjengelig. SD-oktober sensitivitet er målt til å være bedre enn 90 dB.
3. Skanning Scheme
   1. Fast 2-D raster avsøkning av galvanometer styres av et analogt utgangskort (PCI-6731, National Instruments), som også utløser både PAOM laser avfyring og signalet kjøpet av oktober spektrometer. Som et resultat, er dataene oppkjøp i PAOM og Oct delsystemer synkronisert.
   2. Den PAOM datainnsamlingen er utløst av en fotodiode opptak PAOM laser sekvens (se 1.1.2).
   3. 3-D volumetriske bilder eller 2-D fundus bilder er konstruert fra 256 B-scan bilder (256 A-linjer per BSkanne bildet).

2. System Alignment

1. Maksimere frekvens-dobling effektiviteten av BBO krystall og koplingsvirkningsgrad av single-modus optisk fiber. Slitasje LG3 briller (Thorlabs) for personell øyebeskyttelse når optimalisere PAOM opplysende lys.
2. Collimate fiber utgang laser av PAOM til 2,0 mm i diameter.
3. Juster den kombinerte belysning lys av PAOM og SD-OCT å være koaksial.
4. Still PAOM eksitasjon lys på ~ 40 NJ / puls og SD-OCT sondering lys på ~ 0,8 mW, som begge rapporteres å være øye trygg ^6,12.

3. In vivo Multimodal Retinal Imaging

1. Overfør rotte til en gjennomsiktig polypropylen boksen og anesthetize dyret av en blanding av isofluran (Phoenix farmasøytisk, Inc.) og vanlig luft ved en konsentrasjon på 1,5% og en strømningshastighet på 2,0 liter / min i 10 min.
2. Dempe bedøvet rotte i en homemade holder med fem-akse justerbar frihet (figur 1), og beholde sin kroppstemperatur på ~ 37 ° C ved en oppvarming pad (Repti therm, Zoomete laboratorier, Inc.). Opprettholde anestesi ved innånding gass av blandet isofluran og vanlig luft med 1,0% konsentrasjon og 1,5 liter / min strømningshastighet gjennom hele forsøket.
3. Kutt øyevipper med en kirurgisk saks, strekke elevene med 1% Tropicamide øyedråper, og lamme iris sphincter muskel bruker 0,5% Tetrakain hydroklorid øyedråper. Påfør kunstige rive dråper (Systane, Alcon Laboratories, Inc.) til rotte øyet hvert andre minutt for å hindre hornhinnen dehydrering og katarakt. Overvåke dyret hjertefrekvens, respirasjon, og blod oksygenering av et pulsoksymeter (8600 V, Nonin Medical, MN) under bildebehandling.
4. Slå på SD-OCT opplysende lys og sjekk sondering lett å være ~ 0,8 mW.
5. Aktiver galvanometer skanning. Juster SD-OCT bestråling lys leveringpå rotte netthinnen og identifisere retinal regionen av interesse (ROI) ved å justere fem-akse dyr holder. Her er den optiske disken forsettlig plassert i sentrum av synsfeltet, mens ROI bør velges basert på ulike forskningsbehov.
6. Videre justere dyret holder å optimalisere SD-okt bildebehandling kvaliteter retinal tverrsnitt i begge skanning retninger (ved å bytte raster skanning retning) til beste optiske fokus er nådd.
7. Forbered nålen svinger på en fem-akse justerbar plattform, bruke en dråpe av ultralyd gel til transduseren spissen, og forsiktig kontakt svingeren tips til dyret øyelokk.
8. Still PAOM laseren til eksterne-trigger, starter galvanometer skanning, og aktivere sanntids visning av PAOM tverrsnitt bilde av dyret netthinnen. Avstemme svingeren orientering til PAOM bildet har den beste signal-til-støy-forhold (SNR), og i mellomtiden, viser en jevnt distributed PA amplitude mønstre i begge skanning retninger.
9. Still skanning parametere og gjennomføre samtidig retinal avbildning av SD-OCT og PAOM. Rekonstruere tredimensjonale bilder av SD-OCT og PAOM off-line. Våre gjenoppbygging koder ble skrevet i Matlab og tredimensjonal visualisering ble oppnådd uing et freeware (Volview, Kitware). Algoritmen for SD-oktober gjenoppbygging kan bli funnet i Ref. ¹¹ og algoritmen for PAOM gjenoppbygging kan bli funnet i Ref. ⁶ og Ref. ^13. Gjenta om nødvendig fremgangsmåten på 3,7) -3,9).
10. Etter forsøket, slå av SD-OCT sondering lys, fjerne dyret fra holderen umiddelbart, og holde den varm før den våkner naturlig. Holde dyret i et mørkt miljø for en ekstra time for øynene å komme seg. Hele eksperimentelle varighet, inkludert dyr anestesi og Imaging Acquisition, er mindre enn 30 min for en erfaren operatør.

Representative Results

Figur 2 viser de 2-D fundus bilder av SD-oktober og PAOM ervervet samtidig i en albino rotte (A og B) og en pigmentert rotte (C og D), respektivt. I SD-okt fundus bilder (Fig. 2A og 2C), retinale blodkar har mørk utseende på grunn av hemoglobin absorpsjon av sondering lys. I tillegg til retinale blodkar (RV i figur 2B), visualiserer PAOM de koroidal vasculatures (CV i figur 2B) i albino øye på grunn av manglende RPE melanin. Fordi pigmentert øye har høy melanin konsentrasjon, PAOM images RPE (figur 2D) med høy kontrast i tillegg til de retinale blodkar. I alle retinal bildebehandling, er den maksimale skanning vinkel 26 grader og bildebehandling oppkjøpet tar ~ 2,7 sek. For å demonstrere den tredimensjonale avbildning evnen PAOM, er en volumetrisk gjengivelse av dataene som er vist i figur 2b gitt i Figure 3.

Figur 1. Fotografi av de fem-aksen dyr holder. Pilene 1-5 markere de fem justerbare friheter og pilen 6 høydepunkter dyret restrainer.

Figur 2. Samtidig kjøpt SD-oktober (A og C) og PAOM (B og D) fundus bilder. A) og B) er ervervet fra en albino rotte, og C) og D) er ervervet fra et pigmentert rotte. RV: retinal fartøyet, CV: koroidal fartøyet, RPE: retinal pigment epitel. Bar: 500 mikrometer.

<strong> Figur 3. Volumetrisk visualisering av PAOM i en albino rotte netthinnen.

Discussion

Her presenterer vi en detaljert instruksjon om samtidig in vivo retinal avbildning av rotte øynene med PAOM kombinert med SD-oktober Optisk-scattering-baserte SD-oktober er kanskje den kliniske "gullstandarden" for retinal avbildning ^3, men det er ikke følsom for detektere optisk absorpsjon i retina. Det nyutviklede PAOM er den eneste optisk absorpsjon-baserte oftalmisk imaging modalitet som gir optiske absorpsjonsegenskaper i netthinnen ^6. Fordi hemoglobin og melanin er endogent sterke optiske absorberende pigmenter, gjør PAOM etterforsker av anatomi og funksjoner av netthinnens / koroidal fartøy og RPE uten å ty til ytterligere kontrastmidler.

I PAOM har ufokusert ultralyd transducer en begrenset følsomhet region (~ 2,8 × 2,8 mm ^{2) 10} på grunn av sin endelige aktivt element, som fører til en råtten deteksjonsfølsomheten av PA signaler mot than periferien av synsfelt (FOV). Således bør tippvinkel av svingeren justeres nøye for å oppnå en homogen retinal FOV. En potensiell erstatning for den tradisjonelle piezoelektrisk transduktor er å anvende mikro-ring resonatoren, som har mindre støy ekvivalente trykkverdiene og bredere deteksjon retningsvirkning ^14, som kan gi en mer homogen retinal bilde med bedre SNR i PAOM. Sammenligning med SD-OCT har PAOM lignende lateral oppløsning (~ 20 mikrometer), men mye verre aksial oppløsning (~ 23 mikrometer) på grunn av foreløpig begrenset ultralyd båndbredde ^6. Den aksiale oppløsningen PAOM potensielt kan forbedres ved anvendelse av nye ultralyddetektor samt. Kalibreringen metode for PAOM vedtak ble tidligere omtalt ^6,15.

Oppsummert tilbyr integrerte PAOM og SD-OCT imaging system mer omfattende anatomiske og funksjonelle vurdering av netthinnen, og derfor har store løfter ifremtiden klinisk diagnose og ledelsen av mange øyelidelser.