Summary
Фотоакустический офтальмологии (PAOM), оптического поглощения на основе изображений модальности, обеспечивает дополнительную оценку сетчатки в настоящее время технологии офтальмологических изображений. Мы сообщаем об использовании PAOM интегрирована с спектральной области оптической когерентной томографии (SD-OCT) для одновременного мультимодального изображения сетчатки у крыс.
Abstract
Как клинический диагноз и фундаментальные исследования основных заболеваний глазного извлечь большую пользу из различных неинвазивных технологий офтальмологических изображений. Существующие методы визуализации сетчатки, таких как фотографии глазного дна 1, конфокальной лазерной офтальмоскопии сканирования (cSLO) 2 и оптической когерентной томографии (ОКТ) 3, имеют значительный вклад в мониторинг заболевания приступы и прогрессии, и разработки новых терапевтических стратегий. Тем не менее, они в основном полагаются на задней отраженных фотонов от сетчатки. Как следствие, оптические свойства поглощения сетчатки, которая, как правило, тесно связаны с сетчатки статус патофизиологии, недоступные в традиционных технологий обработки изображений.
Фотоакустический офтальмоскопия (ПАОМ) является новым сетчатки метода визуализации, что позволяет обнаружить оптические контрасты поглощения в глаза с высокой чувствительностью 4-7. В PAOM нанимпульсов лазерного osecond доставляются через зрачок и сканировать по заднему глаза, чтобы вызвать фотоакустических (PA) сигналы, которые обнаруживаются сфокусировано ультразвуковой датчик крепится к веку. Из-за сильного оптического поглощения гемоглобина и меланина, PAOM способны неинвазивно изображения сетчатки и сосудистой оболочки vasculatures и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) меланина при высоких контрастах 6,7. Что еще более важно, основанные на хорошо развитую спектроскопических изображений фотоакустических 5,8, PAOM имеет потенциал, чтобы отобразить насыщения гемоглобина кислородом в сосуды сетчатки, которая может иметь решающее значение в изучении физиологии и патологии несколько ослепительно заболеваний 9 таких как диабетическая ретинопатия и неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации.
Кроме того, являясь единственным существующим оптического поглощения на основе метода визуализации офтальмологические, PAOM может быть интегрирована с хорошо известными клинических офтальмологических изображений тэchniques для достижения более полной анатомической и функциональной оценки глазу на основе нескольких оптических контрастов 6,10. В этой работе, мы интегрируем PAOM и спектрально-домен октября (SD-OCT) для одновременного в естественных условиях изображения сетчатки крысы, где и оптического поглощения и рассеяния свойства сетчатки выявлено. Конфигурации системы, системы выравнивания изображений и приобретение представлены.
Protocol
1. Конфигурация системы
- Подсистема PAOM
- Освещение источник: Nd: YAG-лазер (SPOT-10-100, Elforlight Ltd, UK: 20 мкДж / импульс, 2 нс длительность импульса; 30 кГц максимальная частота повторения импульсов).
- Мощность лазера на длине волны 1064 нм с удвоенной частотой до 532 нм бета-бората бария (ВВО) кристалл (CasTech, San Jose, CA). После дальнейшего раскола в зеркале лазерной линии, 532 нм свет поступает через одномодового оптического волокна (P1-460A-FC-5, Thorlabs) и 1064 нм лазер, записанные на фотодиод (DET10A, Thorlabs), который вызывает PA сигнал приобретения.
- Лазерный луч выходит из одномодового оптического волокна подается на сетчатку с помощью гальванометра (GM, QS-7, Nutfield Technology) и телескоп конфигурации (f1 = 75 мм и f2 = 14 мм, Эдмунд оптики) 6.
- Сфокусировано датчик иглы (40-МГц центральная частота, 16-МГц, 0,4 × 0,4 мм 2 размер активного элемента, NIH ресурсов Centeг для ультразвуковой технологии преобразователя, Университет Южной Калифорнии) находится в контакте с веко, чтобы обнаружить PA сигналы от сетчатки. Ультразвуковой гель (Sonotech) применяется между наконечником датчика и животных века для хорошего акустического контакта.
- Сигнал PA усиливается двумя усилителями (ZFL-500LN +, Mini-Circuits, и 5073PR, Olympus) и оцифровывается платы сбора данных (CS14200, Гейдж прикладной).
- SD-OCT Subsystem
- Температура источника света согласованности: широкополосный супер-люминесцентными диод (IPSDD0804, InPhenix; центр длине волны: 840 нм; 6-дБ полоса пропускания: 50 нм), которая определяет осевое разрешение 6 мкм.
- Ближнего инфракрасного света разделяется ссылаться на руку и образцы руку от 50 × 50 настроенной одномодовый волоконный ответвитель (OZ Optics).
- После объединения с легкой PAOM освещающей по горячим зеркало (FM02, Thorlabs), октябрь образца руку разделяет те же проверки и доставки оптики Wiго PAOM 6.
- Самодельный спектрометр используется для записи SD-OCT сигналы помех, где линия сканирования CCD камера (Aviiva SM2, e2v) позволяет линии ставке 24 кГц. Дизайн типичных спектрометры могут быть найдены из нескольких ранее опубликованной литературы 11 и волоконно-связанных SD-OCT-спектрометров в настоящее время коммерчески доступны. SD-OCT чувствительности измеряется быть лучше, чем 90 дБ.
- Сканирование схеме
- Быстро 2-D растровые сканирования гальванометра контролируется аналоге выхода платы (PCI-6731, National Instruments), который также вызывает как стрельба PAOM лазерных и сигнал приобретение октября спектрометра. В результате данных приобретений в PAOM и октябре подсистем синхронизированы.
- Приобретение PAOM данных вызвана фотодиод записи PAOM лазерных последовательности (см. 1.1.2).
- 3-D объемных изображений или 2-D изображение глазного дна строятся из 256 B-сканов (256-линий на BСканирование изображения).
2. Система выравнивания
- Максимально удвоения частоты эффективность кристалла ВВО и связи эффективности одномодового оптического волокна. Носите защитные очки LG3 (Thorlabs) для защиты глаз персонала при оптимизации свет освещает PAOM.
- Наведитесь волоконного лазера выход PAOM до 2,0 мм в диаметре.
- Совместите комбинированные фары освещения PAOM и SD-OCT быть коаксиальными.
- Установить PAOM возбуждении светом при ~ 40 NJ / пульс и SD-OCT зондирующего света на ~ 0,8 мВт, оба из которых, как сообщается, безопасен для глаз 6,12.
3. В естественных условиях Мультимодальные изображения сетчатки
- Передача крысы прозрачной коробке полипропилена и обезболивать животных смесью изофлурана (Phoenix фармацевтической, Inc) и нормальным воздухом в концентрации 1,5% и расходе 2,0 л / мин в течение 10 мин.
- Сдерживать наркозом крыса в homemaде-держатель с пяти осям регулируемые свободы (рис. 1), и держать температуру тела при температуре ~ 37 ° C на грелку (Repti Therm, Увеличенный Laboratories, Inc). Поддержание анестезии при вдыхании газа смешанной изофлурана и обычный воздух с концентрацией 1,0% и 1,5 л / мин скорость потока в течение всего эксперимента.
- Вырезать ресниц помощью хирургических ножниц, расширяются зрачки с 1% офтальмологического раствора Тропикамид, и парализовать мышцы радужной оболочки сфинктера с использованием 0,5% Тетракаин офтальмологического раствора гидрохлорида. Применение капель искусственной слезы (Systane, Alcon Laboratories, Inc) для крыс глаза каждую минуту, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и катаракты. Следите за скоростью животных сердца, дыхание и насыщение крови кислородом с помощью пульсоксиметра (8600 V, Nonin медицинская, MN) во время съемки.
- Включите SD-OCT свет, освещающий и проверить зондирующего света, чтобы быть ~ 0,8 мВт.
- Активировать гальванометра сканирования. Совместите SD-OCT облучения светом доставкойна сетчатке крыс и определить сетчатки области интереса (ROI) путем корректировки пять оси животного владельцу. Здесь, диск зрительного нерва намеренно помещают в центр поля зрения, в то время как рентабельность должна быть выбрана на основе различных требований исследований.
- Дальнейшие настройки животное держатель для оптимизации SD-OCT изображений качеств сетчатки сечения в обоих направлениях сканирования (путем переключения направления растрового сканирования) пока лучший оптический фокус будет достигнута.
- Подготовка иглы преобразователя на пять оси регулируемые платформы, нанесите каплю ультразвукового геля на кончике датчик и аккуратно обращаться преобразователя наконечник для животных века.
- Установить PAOM лазер с внешним триггером режиме, запустить сканирование гальванометр, и активировать отображение в реальном времени из PAOM поперечного сечения образ животного сетчатки. Тщательно отрегулируйте датчик ориентации, пока изображение не PAOM имеет лучшее отношение сигнал-шум (SNR) и, в то же время, показывает, равномерное расстояниеributed модели PA амплитуды в обоих направлениях сканирования.
- Установите параметры сканирования, а также проводить одновременно сетчатке изображений SD-OCT и PAOM. Реконструкция трехмерного изображения SD-OCT и PAOM офф-лайн. Наши коды реконструкции были написаны в Matlab и трехмерной визуализации была достигнута uing бесплатный (Volview, Kitware). Алгоритм для SD-OCT реконструкции можно найти в работе. 11 и алгоритма реконструкции PAOM можно найти в работе. 6 и Ref. 13. Если необходимо, повторите процедуры 3,7) -3,9).
- После эксперимента, отключить SD-OCT зондирующего света, удалить животное из держателя сразу, и он оставался в тепле, пока она проснется естественным образом. Держать животных в темном помещении в течение дополнительного часа для глаз, чтобы восстановиться. Весь экспериментальный продолжительности, в том числе анестезии животных и визуализации приобретения, составляет менее 30 мин для опытного оператора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показан 2-D изображение глазного дна SD-OCT и PAOM приобрела одновременно в белых крыс (А и В) и пигментированные крысы (C и D), соответственно. В SD-OCT изображение глазного дна (рис. 2А и 2В), сосуды сетчатки имеют темно появление связано с гемоглобином поглощения зондирующего света. В дополнение к сосуды сетчатки (RV в рис. 2В), PAOM визуализирует хориоидеи vasculatures (CV в рис. 2В) у белых глаз из-за отсутствия НПП меланина. Потому что пигментированных глаз имеет высокую концентрацию меланина, PAOM изображений ПЭС (рис. 2D) с высокой контрастностью в дополнение к сосуды сетчатки. Во всех изображений сетчатки, максимальный угол сканирования составляет 26 градусов, а изображение приобретение занимает ~ 2,7 сек. Для демонстрации трехмерных изображений Возможность PAOM, объемная визуализация данных показана на рисунке 2б приведены в FigurE 3.
Рисунок 1. Фотография из пяти осям животного владельцу. Стрелки 1-5 выделить пять регулируемых свобод и стрелка 6 основных моментов животных фиксатор.
Рисунок 2. Одновременно приобрел SD-OCT (А и С) и PAOM (B и D) глазного дна изображений. А) и Б), приобретенные у белых крыс, и C) и D) были приобретены у пигментированных крысы. RV: сетчатки судна; CV: хориоидеи судна; ПЭС: пигментный эпителий сетчатки. Бар: 500 мкм.
<сильная> Рисунок 3. Объемная визуализация PAOM в сетчатке крыс альбиносов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим подробную инструкцию по одновременной в естественных условиях изображения сетчатки глаза крысы использованием PAOM в сочетании с SD-октябре Оптический рассеяние на основе SD-OCT является, пожалуй, клинические «золотой стандарт» для изображения сетчатки 3, однако он не чувствителен для обнаружения оптического поглощения в сетчатке. Недавно разработанная PAOM является единственным оптического поглощения на основе офтальмологических изображений методом, который обеспечивает оптические свойства поглощения сетчатки 6. Потому что гемоглобин и меланин являются эндогенно сильные оптические пигменты, поглощающие, PAOM позволяет следственным анатомии и функции сетчатки / хориоидеи суда и ПЭС, не прибегая к дополнительным контрастных веществ.
В PAOM, вне фокуса ультразвуковой датчик имеет ограниченную область чувствительности (~ 2,8 × 2,8 мм 2) 10 благодаря своей конечной активный элемент, который вызывает гнилые чувствительность обнаружения сигналов PA к тОн периферии поля зрения (FOV). Таким образом, угол наклона преобразователя должны быть тщательно доводят до получения однородной сетчатки FOV. Потенциальной замены для традиционных пьезоэлектрических преобразователей заключается в применении микро-кольцевой резонатор, который имеет низкий уровень шума эквивалентные значения давления и широкой направленности обнаружения 14, который может обеспечить более однородное изображение сетчатки с лучшей SNR в PAOM. По сравнению с SD-OCT, PAOM имеет аналогичные боковые разрешение (~ 20 мкм), но гораздо хуже, осевые разрешение (~ 23 мкм) в связи с ограниченным настоящее время ультразвукового пропускной способностью 6. Осевой разрешение PAOM потенциально могут быть улучшены за счет применения новых ультразвуковых детекторов, а также. Метод калибровки резолюций PAOM был предыдущего отчетного 6,15.
Таким образом, интегрированное PAOM и SD-OCT изображений система предлагает более полную анатомическую и функциональную оценку сетчатки, и, следовательно, имеет большие обещания вбудущего клинического диагноза и управления многих заболеваний глаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все экспериментальные процедуры животного были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Северо-западного университета.
Acknowledgments
Мы благодарим щедрой поддержке со стороны Национального научного фонда (КАРЬЕРА конбет-1055379) и Национального института здоровья (1RC4EY021357, 1R01EY019951). Мы также отмечаем поддержку со стороны Китая стипендии Совета Песня Вэй.
References
- Kinyoun, J. L., Martin, D. C., Fujimoto, W. Y., Leonetti, D. L. Ophthalmoscopy versus fundus photographs for detecting and grading diabetic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33 (6), 1888-1893 (1992).
- Schuman, J. S., Wollstein, G., Farra, T., Hertzmark, E., Aydin, A., Fujimoto, J. G., Paunescu, L. A. Comparison of optic nerve head measurements obtained by optical coherence tomography and confocal scanning laser ophthalmoscopy. Am. J. Ophthalmol. 135 (4), 504-512 (2003).
- Strøm, C., Sander, B., Larsen, N., Larsen, M., Lund-Andersen, H. Diabetic macular edema assessed with optical coherence tomography and stereo fundus photography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (1), 241-245 (2002).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V.
Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J. Vis. Exp. (51), e2729 (2011). - Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photonics. 3 (9), 503-509 (2009).
- Jiao, S., Jiang, M., Hu, J., Fawzi, A., Zhou, Q., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Wei, Q., Liu, T., Jiao, S., Zhang, H. F. Image chorioretinal vasculature in albino rats using photoacoustic ophthalmoscopy. J. Mod. Optic. 58 (21), 1997-2001 (2011).
- Liu, T., Wei, Q., Wang, J., Jiao, S., Zhang, H.F Combined photoacoustic microscopy and optical coherence tomography can measure metabolic rate of oxygen. Biomed. Opt. Express. 2 (5), 1359-1365 (2011).
- Yu, D., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Prog. Retin. Eye Res. 20 (2), 175-208 (2001).
- Song, W., Wei, Q., Liu, T., Kuai, D., Burke, J. M., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrating photoacoustic ophthalmoscopy with scanning laser ophthalmoscopy, optical coherence tomography, and fluorescein angiography for a multimodal retinal imaging platform. J. Biomed. Opt. 17 (6), 061206 (2012).
- Mark, E. Brezinski Optical Coherence Tomography: Principles and Applications. , Academic Press. (2006).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V.
Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt. Lett. 35 (1), 1-3 (2010). - Zhang, H. F., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo imaging of subcutaneous structures using functional photoacoustic microscopy. Nature protocols. 2, 797-804 (2007).
- Ling, T., Chen, S. L., Guo, L. J. High-sensitivity and wide-directivity ultrasound detection using high Q polymer microring resonators. Appl. Phys. Lett. 98 (20), 204103 (2011).
- Xie, Z., Jiao, S., Zhang, H. F., Puliafito, C. A.
Laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 1771-1773 (2009).