Постоянный церебральный окклюзия судна<em> С помощью</em> Двойной лигатура и Перерезка

Summary

Опишем высоко воспроизводимым методом для постоянной окклюзии грызунов основных церебральных кровеносных сосудов. Этот метод может быть достигнуто с очень небольшим повреждением периферических, минимальные потери крови, высокий уровень долгосрочное выживание и в соответствии объем инфаркта соизмеримый с человеческим клинических населения.

Abstract

Инсульт является одной из ведущих причин смерти, инвалидности и социально-экономические потери по всему миру. Большинство все штрихи в результате прерывания кровотока (ишемии) ^1. Средней мозговой артерии (МСА), обеспечивает большую часть крови к боковой поверхности коры ^2, является наиболее распространенным сайт человеческой инсульт ³ и ишемии на его территории может привести к обширному дисфункцию или гибель ^1,4,5. Пережившие ишемического инсульта часто страдают потерей или нарушением возможности двигателя, сенсорного дефицита и инфарктом. В попытке захватить эти ключевые характеристики инсульта, и тем самым развивать эффективное лечение, большой акцент делается на животных моделях ишемии в MCA.

Здесь мы представляем метод постоянной закупорки кровеносных сосудов коркового поверхности. Мы представим этот метод на примере соответствующих окклюзии судно, которое моделирует наиболее распространенный тип, расположение и OUTCOMе человека инсульт, постоянные окклюзии средней мозговой артерии (pMCAO). В этой модели, мы подвергать хирургическим MCA во взрослой крысы, а затем закрывают через двойные лигатуры и перерезка сосуда. Это pMCAO блокирует проксимальных корковых филиал MCA, вызывая ишемию во всех MCA территории коры, большая часть коры головного мозга. Этот метод окклюзии может также использоваться для окклюзии более дистальных отделах корковых сосудов с целью достижения более фокальной ишемии ориентации меньший области коры головного мозга. Основными недостатками pMCAO в том, что хирургическая процедура занимает несколько инвазивных как небольшой трепанации черепа требуется для доступа к MCA, хотя это приводит к минимальным повреждением тканей. Основными преимуществами данной модели, однако, являются: места окклюзии корректно определено, степень снижения артериального потока является последовательной, функциональной и неврологическими нарушениями происходит быстро, размер инфаркта является последовательной, и высокая выживаемость позволяет использовать длительные Термин хроническая оценки.

Introduction

Для того, чтобы индуцировать ишемических состояний, которые эффективно имитировать человеческое ишемический инсульт, инсульт несколько моделей животных широко используются, с различной объема инфаркта в результате. В фототромботического модель, мозг облучают через неповрежденную черепа использованием лазерного излучения после внутривенного введения светочувствительного вещества (например, бенгальского розового), в результате фотохимической коагуляции, блокирование облученного сосудов и ишемия в окружающие ткани ^{6, 7.} Фототромбоза может привести к очень маленьким, изолированные области инфаркта и обычно используется как средство моделирования "мини-ударов" или "микро-ударов".

Более широкое применение техники для индукции ишемического инсульта, особенно в средней мозговой артерии (MCA), является внутрипросветного модель мононити ^8, в которой нити хирургическим путем вводится в наружную сонную артерию и продвинулись, пока наконечник перекрывает основание MCA. PRIМария задача внутрипросветных окклюзии нити высокой смертностью (70%, когда MCA поглощается в течение 3 часов, соответствующие моменту времени для хода исследования) ^9. Другие проблемы с методом включены возможные субарахноидального кровоизлияния, неполные окклюзии, и переменный объем инфаркта ^10,11. Эта модель приводит к обширным инфарктом степени как в коре и подкорково ^12, и модели массивных человека инсульт.

Хотя оба микро-и обширный инсульт модели важны, человеческие Обычно удары где-то посередине. В крупных клинических исследованиях, инсульт инфаркт диапазоны в размере от 28-80 см ^3, что в переводе с 4.5-14% от ипси-ишемическая полушарии ^9. Для сравнения, наши крысы pMCAO размер инфаркта в диапазоне от приблизительно 9-35 мм ^3, которая составляет от 3 ​​до 12% от ипси-ишемических полушарии. Наши pMCAO модели, таким образом, напоминает человека ишемического инсульта объемы инфаркта мозга процентобъема.

В дополнение к моделированию структурных повреждений инсульта, pMCAO результатов в функциональных и поведенческих дефицитов похоже на состояние человека. Как минимум, эффективные модели инсульта приводит к дефициту движения контралатеральной повреждение хода ^13-15, потери или нарушения чувствительности и моторной функции ^16,17, потери или разрушения вызвала активность нейронов ^16,18, снижение мозгового кровотока ^{19, 20, 21,22} и инфаркта. Соответственно, наши pMCAO моделей серьезной окклюзии средней мозговой артерии приводит к инвалидности, потеря функции в сенсорной коре (и соседних коры), нарушению нейронной активности, резкому сокращению кровотока MCA, и инфаркт-признак атрибутами ишемического инсульта ^{23 -25,} поэтому выступающей в качестве эффективной модели человеческого инсульта.

Процедурном pMCAO включает небольшой трепанации черепа, в которых мы осторожно удалить черепа и оболочки из2 х 2 мм "хирургического окна» по начальной (M1) сегмент СМА, незадолго до первичной бифуркации MCA в передних и задних корковых ветвей (рис. 1А и 1В). Проходим половину кривой Режущая иглы и нити шва (6-0 шелк) через слой мягкой мозговой оболочки мозговых оболочек, ниже и выше MCA поверхности коры (см. Таблица специфических реагентов и оборудования для хирургических материалов, необходимых для проведения pMCAO ). Мы затем связать двойные лигатуры, затяните два узлы вокруг MCA, и секут судна между двумя узлами. Двойные лигатуры и рассечение происходит через M1, расположенной по периферии lenticulostriate ветвления, так что только корковых ветвях MCA-страдают таким образом, только корковых инфарктов (без подкорковые повреждения) происходит ^26,27 (рис. 2). Хотя человека инсульт, часто включает в себя подкорковые инфаркты, моделирование этого у грызунов требует увеличения инвазивности (закупорки сосудов головного мозга до коркового Branchiнг, требует обращения к артериям через сонную артерию на шее и требует дополнительных окклюзии) в технике и усиление изменчивости размера инфаркта. Модели, описанные здесь, могут быть выполнены более проксимально, как доступ к ранее ветвей ФВТ не возможно с помощью простой краниотомия. Хотя это может быть хирургическим путем можно вызвать с помощью подкорковых инфарктов pMCAO, окклюзия повлечет за собой крайне инвазивной процедурой и, следовательно, не является идеальным.

Эффективность окклюзии может быть подтверждено с помощью лазерной доплеровской или лазерной спекл-изображений ^12,24,25 (рис. 3), или гистологическое посмертные (рис. 2). Следует отметить, что предыдущие исследования показали, что сенсорная стимуляция может играть важную роль в эволюции и исход инфаркта; обеспечить защиту от повреждений при приеме в течение 2 ч pMCAO и вызывая увеличение ударного повреждения при введении в 3 часа после pMCAO ^24,25,28. Мы подтвердили, что в 5 часов после pMCAO, стимуляция больше не влияет на результат (неопубликованные данные). Таким образом, сенсорная стимуляция субъектов должны быть сведены к минимуму в течение 5 часов после получения pMCAO объемы инфаркта с минимальной изменчивостью. Соответственно, наша группа не проходит "необработанным контролем" такого типа, сохраняя крыс под наркозом в течение 5 ч после pMCAO, в темноте, с минимальным сенсорной стимуляции, и прямо не усов стимуляции.

Кроме того, следует отметить, что случайные изменения в структуре МСА, в том числе чрезмерного ветвления, несколько первичных сегментов или отсутствие связи артерии может происходить с частотой от 10 до 30% взрослого мужчины Sprague Dawley крыс ^29,30. Если нарушения в MCA наблюдаются, желательно не использовать эту конкретную тему, как добавление животных с такими сосудистые аномалии увеличится инфаркта изменчивости.

Кроме того, существует несколько практических аспектов оUR процедуры, которые делают этот метод окклюзии выгодным для хода расследования. Во-первых, швы могут быть размещены вокруг артерии, но не затянуты, чтобы собрать базовую оценку, а затем после ишемии оценка после лигатуры и рассечения. Таким образом, хирургическая подготовка необходимых для эффективной окклюзии контролировали в течение предметов. Поскольку объектами может оставаться неподвижным или в стереотаксической раме всей окклюзии, можно проводить экспериментальные оценки каждого субъекта до, во время и после окклюзии без перемещения объекта или нарушения любого экспериментального оборудования, используемого ^25,28. Кроме того, эта процедура приводит к очень низкой смертности, даже в возрасте субъектов грызунов 21-24 месяцев (эквивалент пожилого человека) ^31, и поэтому может быть использован для оценки лечения инсульта у крыс, которые более точно смоделировать наиболее распространенных возрасте от инсульта страдает ^25,28. Судно transectioN также выполняет несколько практических целей. Отсутствие кровотечение после рассечения подтверждает, что полной закупорки сосудов в обоих лигатуры сайтов. Кроме того, пересечение создает постоянное нарушение кровотока. Наконец, пересечение гарантирует, что любой поток крови обнаружены в дистальной части закупоренный сосуд должны происходить из другого источника.

Наконец, хотя мы конкретно описать этот метод для окклюзии МСА в этой рукописи и видео, те же технике двойного рассечения лигатуры могут быть применены к любому церебральный судна, которые могут быть доступны через краниотомия. Наша лаборатория, например, использованы pMCAO в сочетании с несколькими дополнительными постоянными окклюзии дистальных ветвей MCA для того, чтобы блокировать как первичный, и обеспечения притока крови ²⁴ таким образом, чтобы аналогичные методы, призванные избирательно вызывать ишемию в первичной соматосенсорной коре ^32.

В заключение, тего метод для постоянной окклюзии применительно к MCA близко моделирует три основные аспекты человеческой ишемического инсульта: наиболее распространенным расположение (MCA), тип (ишемии) и степени повреждения (инфаркт), связанные с человеческим клинической литературы инсульта. Кроме того, этот метод окклюзии может быть применено к одной или нескольких местах по всей окклюзии мозга, и может быть проведена в возрасте субъектов с высокой скоростью на выживание. Учитывая динамичное, постоянный, неинвазивный и относительно природы этого окклюзии, этот метод представляет собой дополнительный инструмент для доклинической оценки исследователей новых подходов для защиты от и лечения инсульта.

Protocol

1. Приступая к работе: Требуется Хирургические инструменты См. Рисунок 4 Бормашины (Kavo стоматологического оборудования, модель: UMXL-TM), 2-сверло, и 3-сверло Два ~ 30 иглами подкожно Зубчатые пинцета с изогнутыми концами дополнительно (может быть полез…

Representative Results

Успешное окклюзии сосуда может быть подтверждена с помощью лазерного спекл-изображений (LSI) среди других методов кровотока изображений. Кровоток в основных корковых ветвей ФВТ должна упасть до ~ 25% от исходного уровня или меньше следующие окклюзии в зависимости от уровня шума …

Discussion

Этот протокол был разработан для того, чтобы вызвать ишемию в коре грызунов, и делать это с минимальными периферийного воздействия на испытуемых. Двойной прикус и перерезка метод позволяет для визуального подтверждения того, что судно было постоянной окклюзии, и может быть выполнена б…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL