Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.
O AVC é a principal causa de morte, invalidez e perda socioeconômicas em todo o mundo. A maioria de todos os acidentes vasculares cerebrais resultam de uma interrupção do fluxo sanguíneo (isquemia) 1. Artéria cerebral média (MCA) fornece uma grande maioria de sangue para a superfície lateral do córtex 2, é o local mais comum de acidente vascular cerebral humano 3, e isquemia no seu território pode resultar em disfunção extensa ou morte 1,4,5. Sobreviventes de acidente vascular cerebral isquêmico, muitas vezes sofrem perda ou rompimento das capacidades motoras, deficiências sensoriais e infarto. Em um esforço para capturar estas características fundamentais de acidente vascular cerebral e, assim, desenvolver um tratamento eficaz, uma grande ênfase é colocada em modelos animais de isquemia em MCA.
Aqui apresentamos um método de oclusão permanentemente uma cortical dos vasos sanguíneos da superfície. Vamos apresentar este método usando um exemplo de uma oclusão do vaso relevante que modela o tipo mais comum, localização e outcome de acidente vascular cerebral humano, oclusão da artéria cerebral média permanente (pMCAO). Neste modelo, expomos cirurgicamente MCA no rato adulto e, subsequentemente, através de ocluir ligadura dupla e transecção da embarcação. Isto bloqueia o ramo pMCAO cortical proximal do MCA, causando isquemia em todos MCA território cortical, uma grande porção do córtex. Este método de oclusão pode também ser utilizado para ocluir porções mais distais dos vasos corticais, a fim de alcançar mais de isquemia focal como alvo uma região menor do córtex. As principais desvantagens da pMCAO são que o procedimento cirúrgico é pouco invasivo como uma pequena craniotomia é necessário para aceder MCM, no entanto, isso resulta em dano mínimo do tecido. As principais vantagens deste modelo, no entanto, são os seguintes: o local de oclusão está bem definida, o grau de redução do fluxo sanguíneo é consistente, funcional e disfunção neurológica ocorre rapidamente, o tamanho do enfarte é consistente, e a elevada taxa de sobrevivência a longo permite avaliação crônica prazo.
A fim de induzir eficazmente condições isquémicas que imitam AVC isquémico humano, existem vários modelos animais tempos são amplamente empregados, com diversos volumes de enfarte resultantes. No modelo photothrombotic, o cérebro é irradiada através do crânio intactos utilizando iluminação do laser após a injecção intravenosa de uma substância fotossensível (como cor-de-bengala), resultando em coagulação fotoquímica, obstrução dos vasos irradiados, e isquemia no tecido circundante 6, 7. Indocianina pode resultar em regiões muito pequenas, isolados de enfarte e é tipicamente utilizado como um meio de modelação "mini-derrames", ou "micro-enfartes".
A técnica mais frequentemente adoptada para a indução de acidente vascular cerebral isquémico, particularmente na artéria cerebral média (MCA), é o modelo de monofilamentos intraluminal 8, na qual um filamento é introduzido cirurgicamente para dentro da artéria carótida externa e avançou até a ponta oclui a base da MCA. A primary desafio de oclusão filamento intraluminal é a alta taxa de mortalidade (70% quando a MCA está obstruído por 3 horas, um ponto de tempo relevantes para a investigação AVC) 9. Outros problemas com o método incluído possível hemorragia subaracnóide, oclusão incompleta, e volume de infarto variável 10,11. Este modelo resulta num grande grau de enfarte, tanto no córtex e subcorticalmente 12 e os modelos de um acidente vascular cerebral humano. Maciça
Embora ambos micro e acidente vascular cerebral maciço modelos são importantes, traços humanos são normalmente algures no meio. Em grandes estudos clínicos, acidente vascular cerebral infarto varia em tamanho 28-80 cm 3, o que se traduz em 4,5-14% do hemisfério ipsi-ishemic 9. Em comparação, os ratos pMCAO enfarte tamanho varia de cerca de 9-35 mm 3, a qual é constituída por 3 a 12% do hemisfério ipsi ishemic. Nosso modelo pMCAO, portanto, se assemelha volumes infarto AVC isquêmico humanos pela porcentagem de cérebrovolume.
Além de modelar o dano estrutural do curso, resultados pMCAO nos défices funcionais e comportamentais semelhantes à condição humana. No mínimo, um modelo eficaz de resultados do curso em déficits de movimento contralateral à lesão AVC 13-15, perda ou interrupção da função motora e sensorial 16,17, perda ou interrupção de atividade neuronal evocada 16,18, a redução no fluxo sanguíneo cerebral 19, 20, e do infarto 21,22. Dessa forma, os modelos pMCAO uma oclusão grave de MCA, resultando em incapacidade física, perda da função dentro do córtex sensorial (e córtices vizinhos), a interrupção da atividade neuronal, uma severa redução no fluxo sanguíneo MCA e atributos infarto característicos da AVC isquêmico 23 -25, portanto, servir como um modelo eficaz de acidente vascular cerebral humano.
Processualmente, pMCAO envolve uma pequena craniotomia em que remova cuidadosamente o crânio e dura deum mm x "janela cirúrgica" 2 2 sobre o segmento inicial (M1) de MCA, imediatamente antes da bifurcação primária de MCA em ramos corticais anterior e posterior (Figuras 1A e 1B). Passamos um reverso agulha de sutura de corte semi-curva e linha (6-0 seda) através da camada pial das meninges, MCA abaixo e acima da superfície cortical (ver Tabela de reagentes e equipamentos específicos para os suprimentos cirúrgicos necessários para realizar pMCAO ). Em seguida, dê um duplo ligadura, aperte os dois nós em torno de MCA, e transecto o navio entre os dois nós. A ligadura dupla e transecção através M1 ocorre apenas distal à ramificação lentículo, de tal modo que apenas os ramos corticais de MCA-são afectados, assim, apenas enfarte cortical (nenhum dano subcortical) ocorre 26,27 (Figura 2). Apesar de AVC humano muitas vezes envolve enfarte subcortical, modelando isso em roedores requer aumento da capacidade de invasão (oclusão de vasos cerebrais antes cortical Branching requer acesso artérias através da artéria carótida no pescoço e necessita de oclusões adicionais) na técnica e aumento da variabilidade no tamanho do infarto. O modelo descrito aqui não pode ser realizada mais proximal como o acesso aos ramos anteriores do MCA não é possível através de uma craniotomia simples. Embora possa ser possível para induzir cirurgicamente um enfarte sub-cortical através pMCAO, oclusão implicaria um procedimento extremamente invasivo e, por conseguinte, não é o ideal.
Eficácia de oclusão pode ser confirmada através de Doppler a laser, ou laser salpico imagiologia 12,24,25 (Figura 3), ou histologicamente post mortem (Figura 2). Deve notar-se que a pesquisa anterior tem mostrado que a estimulação sensorial pode desempenhar um papel importante na evolução e resultado de enfarte; conferir protecção contra danos quando administrados dentro de 2 horas de pMCAO e causando um aumento no dano do curso, quando administrado a 3 horas após pMCAO 24,25,28. Confirmámos que a 5 horas após a pMCAO, a estimulação já não tem um efeito sobre os resultados (dados não publicados). Assim, a estimulação sensorial de sujeitos deverá ser minimizada durante 5 horas seguindo pMCAO obter volumes de enfarte com uma variabilidade mínima. Assim, o nosso grupo vai "controles não tratados" deste tipo, mantendo os ratos anestesiados por 5 horas pós-pMCAO, no escuro, com a estimulação sensorial mínima, e expressamente nenhum estímulo triz.
Deve-se ainda notar que a variação ocasional na estrutura MCA, incluindo a excessiva ramificação, vários segmentos primários, ou a ausência de artérias comunicantes pode ocorrer em uma freqüência de 10 a 30% no sexo masculino adulto Sprague Dawley 29,30. Se anormalidades na MCA são observados, é aconselhável não usar esse assunto em particular como a adição de animais com tais anomalias vasculares vão aumentar a variabilidade do infarto.
Além disso, há vários aspectos práticos de oprocedimento ur que tornam este método de oclusão vantajoso para a investigação derrame. Em primeiro lugar, as suturas podem ser colocados ao redor da artéria, mas não apertou a fim de recolher a avaliação inicial, seguido de avaliação pós-isquêmica após ligadura e transecção. Nesta forma, a preparação cirúrgica necessária para a oclusão é efectivamente controlada por, entre os indivíduos. Como os indivíduos podem permanecer estacionária ou dentro de um quadro estereotáxico durante a oclusão, é possível realizar uma avaliação experimental de cada sujeito, antes, durante, e após a oclusão, sem mover o objecto ou perturbar qualquer equipamento em uso experimental 25,28. Além disso, este procedimento resulta em uma taxa de mortalidade muito baixa, mesmo dentro de assuntos roedores idade 21-24 meses de idade (o equivalente a um humano idoso) 31, e pode, portanto, ser usados para avaliar tratamentos acidente vascular cerebral em ratos que mais de perto o modelo mais comum faixa etária dos portadores de acidente vascular cerebral 25,28. Vessel transection também serve a vários propósitos práticos. A falta de sangramento depois da transecção confirma que o recipiente foi completamente ocluído em ambos os locais de ligadura. Além disso, transection garante uma interrupção permanente do fluxo de sangue. Finalmente, a transecção assegura que qualquer fluxo de sangue detectado nas porções distais do vaso ocluído deve vir de uma fonte alternativa.
Finalmente, embora especificamente descrever a técnica de oclusão para MCA neste manuscrito e vídeo, a mesma técnica transection ligadura dupla pode ser aplicado a qualquer vaso cerebral que pode ser acessado via craniotomia. O nosso laboratório, por exemplo, utilizado em conjunto com pMCAO várias oclusões adicionais permanentes MCA distais dos ramos, a fim de bloquear tanto primário, e do fluxo de sangue colateral 24 de uma maneira semelhante à das técnicas destinadas a induzir selectivamente isquemia no córtex somatossensorial primário 32.
Em conclusão, to seu método de oclusão permanente, tal como aplicado a MCA modela estreitamente três facetas primárias de acidente vascular cerebral humano: a localização mais comum (MCA), tipo (isquemia), e grau de dano (enfarte), associada com a literatura clínica humana de acidente vascular cerebral. Além disso, este método de oclusão pode ser aplicada aos locais de oclusão simples ou múltiplo ao longo do cérebro, e pode ser realizado em doentes idosos com uma elevada taxa de sobrevivência. Dada a natureza dinâmica, permanente e relativamente não-invasivo desta oclusão, esta técnica representa uma ferramenta adicional para os pesquisadores pré-clínicos avaliando novas abordagens para a protecção e tratamento de acidente vascular cerebral.
Este protocolo foi desenvolvido a fim de induzir isquemia dentro do córtex roedor, e a fazê-lo com o mínimo de impacto periférica sujeitos experimentais. A dupla oclusão e método transecção permite a confirmação visual de que o recipiente foi permanentemente obstruída, e pode ser realizado sem invasão excessiva ou danos no tecido, e com uma elevada taxa de sobrevivência. Este protocolo de oclusão pode ser aplicada a qualquer recipiente cortical que podem ser acedidas através craniotomia para induzir isque…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship 788808-41910, o NIH-NINDS NS-NS-066001 e 055832, e O Centro de Investigação Fonoaudiológica NIH Training Grant 1T32DC010775-01.
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1) | Fine Science Tools | 11151-10 | |
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-50 | |
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
6-0 Braided Silk Suture | Fine Science Tools | NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461 |
|
30 gauge needle, ½” length | Fine Science Tools | NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL |