Permanente oclusão vascular cerebral<em> Via</em> Dupla ligadura e transecção

Summary

Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.

Abstract

O AVC é a principal causa de morte, invalidez e perda socioeconômicas em todo o mundo. A maioria de todos os acidentes vasculares cerebrais resultam de uma interrupção do fluxo sanguíneo (isquemia) ^1. Artéria cerebral média (MCA) fornece uma grande maioria de sangue para a superfície lateral do córtex ^2, é o local mais comum de acidente vascular cerebral humano ^3, e isquemia no seu território pode resultar em disfunção extensa ou morte ^1,4,5. Sobreviventes de acidente vascular cerebral isquêmico, muitas vezes sofrem perda ou rompimento das capacidades motoras, deficiências sensoriais e infarto. Em um esforço para capturar estas características fundamentais de acidente vascular cerebral e, assim, desenvolver um tratamento eficaz, uma grande ênfase é colocada em modelos animais de isquemia em MCA.

Aqui apresentamos um método de oclusão permanentemente uma cortical dos vasos sanguíneos da superfície. Vamos apresentar este método usando um exemplo de uma oclusão do vaso relevante que modela o tipo mais comum, localização e outcome de acidente vascular cerebral humano, oclusão da artéria cerebral média permanente (pMCAO). Neste modelo, expomos cirurgicamente MCA no rato adulto e, subsequentemente, através de ocluir ligadura dupla e transecção da embarcação. Isto bloqueia o ramo pMCAO cortical proximal do MCA, causando isquemia em todos MCA território cortical, uma grande porção do córtex. Este método de oclusão pode também ser utilizado para ocluir porções mais distais dos vasos corticais, a fim de alcançar mais de isquemia focal como alvo uma região menor do córtex. As principais desvantagens da pMCAO são que o procedimento cirúrgico é pouco invasivo como uma pequena craniotomia é necessário para aceder MCM, no entanto, isso resulta em dano mínimo do tecido. As principais vantagens deste modelo, no entanto, são os seguintes: o local de oclusão está bem definida, o grau de redução do fluxo sanguíneo é consistente, funcional e disfunção neurológica ocorre rapidamente, o tamanho do enfarte é consistente, e a elevada taxa de sobrevivência a longo permite avaliação crônica prazo.

Introduction

A fim de induzir eficazmente condições isquémicas que imitam AVC isquémico humano, existem vários modelos animais tempos são amplamente empregados, com diversos volumes de enfarte resultantes. No modelo photothrombotic, o cérebro é irradiada através do crânio intactos utilizando iluminação do laser após a injecção intravenosa de uma substância fotossensível (como cor-de-bengala), resultando em coagulação fotoquímica, obstrução dos vasos irradiados, e isquemia no tecido circundante ^{6, 7.} Indocianina pode resultar em regiões muito pequenas, isolados de enfarte e é tipicamente utilizado como um meio de modelação "mini-derrames", ou "micro-enfartes".

A técnica mais frequentemente adoptada para a indução de acidente vascular cerebral isquémico, particularmente na artéria cerebral média (MCA), é o modelo de monofilamentos intraluminal ^8, na qual um filamento é introduzido cirurgicamente para dentro da artéria carótida externa e avançou até a ponta oclui a base da MCA. A primary desafio de oclusão filamento intraluminal é a alta taxa de mortalidade (70% quando a MCA está obstruído por 3 horas, um ponto de tempo relevantes para a investigação AVC) ^9. Outros problemas com o método incluído possível hemorragia subaracnóide, oclusão incompleta, e volume de infarto variável ^10,11. Este modelo resulta num grande grau de enfarte, tanto no córtex e subcorticalmente ¹² e os modelos de um acidente vascular cerebral humano. Maciça

Embora ambos micro e acidente vascular cerebral maciço modelos são importantes, traços humanos são normalmente algures no meio. Em grandes estudos clínicos, acidente vascular cerebral infarto varia em tamanho 28-80 cm ^3, o que se traduz em 4,5-14% do hemisfério ipsi-ishemic ^9. Em comparação, os ratos pMCAO enfarte tamanho varia de cerca de 9-35 mm ^{3, a} qual é constituída por 3 a 12% do hemisfério ipsi ishemic. Nosso modelo pMCAO, portanto, se assemelha volumes infarto AVC isquêmico humanos pela porcentagem de cérebrovolume.

Além de modelar o dano estrutural do curso, resultados pMCAO nos défices funcionais e comportamentais semelhantes à condição humana. No mínimo, um modelo eficaz de resultados do curso em déficits de movimento contralateral à lesão AVC ^13-15, perda ou interrupção da função motora e sensorial ^16,17, perda ou interrupção de atividade neuronal evocada ^16,18, a redução no fluxo sanguíneo cerebral ^{19, 20,} e do infarto ^21,22. Dessa forma, os modelos pMCAO uma oclusão grave de MCA, resultando em incapacidade física, perda da função dentro do córtex sensorial (e córtices vizinhos), a interrupção da atividade neuronal, uma severa redução no fluxo sanguíneo MCA e atributos infarto característicos da AVC isquêmico ^{23 -25,} portanto, servir como um modelo eficaz de acidente vascular cerebral humano.

Processualmente, pMCAO envolve uma pequena craniotomia em que remova cuidadosamente o crânio e dura deum mm x "janela cirúrgica" 2 2 sobre o segmento inicial (M1) de MCA, imediatamente antes da bifurcação primária de MCA em ramos corticais anterior e posterior (Figuras 1A e 1B). Passamos um reverso agulha de sutura de corte semi-curva e linha (6-0 seda) através da camada pial das meninges, MCA abaixo e acima da superfície cortical (ver Tabela de reagentes e equipamentos específicos para os suprimentos cirúrgicos necessários para realizar pMCAO ). Em seguida, dê um duplo ligadura, aperte os dois nós em torno de MCA, e transecto o navio entre os dois nós. A ligadura dupla e transecção através M1 ocorre apenas distal à ramificação lentículo, de tal modo que apenas os ramos corticais de MCA-são afectados, assim, apenas enfarte cortical (nenhum dano subcortical) ocorre ^26,27 (Figura 2). Apesar de AVC humano muitas vezes envolve enfarte subcortical, modelando isso em roedores requer aumento da capacidade de invasão (oclusão de vasos cerebrais antes cortical Branching requer acesso artérias através da artéria carótida no pescoço e necessita de oclusões adicionais) na técnica e aumento da variabilidade no tamanho do infarto. O modelo descrito aqui não pode ser realizada mais proximal como o acesso aos ramos anteriores do MCA não é possível através de uma craniotomia simples. Embora possa ser possível para induzir cirurgicamente um enfarte sub-cortical através pMCAO, oclusão implicaria um procedimento extremamente invasivo e, por conseguinte, não é o ideal.

Eficácia de oclusão pode ser confirmada através de Doppler a laser, ou laser salpico imagiologia ^12,24,25 (Figura 3), ou histologicamente post mortem (Figura 2). Deve notar-se que a pesquisa anterior tem mostrado que a estimulação sensorial pode desempenhar um papel importante na evolução e resultado de enfarte; conferir protecção contra danos quando administrados dentro de 2 horas de pMCAO e causando um aumento no dano do curso, quando administrado a 3 horas após pMCAO ^24,25,28. Confirmámos que a 5 horas após a pMCAO, a estimulação já não tem um efeito sobre os resultados (dados não publicados). Assim, a estimulação sensorial de sujeitos deverá ser minimizada durante 5 horas seguindo pMCAO obter volumes de enfarte com uma variabilidade mínima. Assim, o nosso grupo vai "controles não tratados" deste tipo, mantendo os ratos anestesiados por 5 horas pós-pMCAO, no escuro, com a estimulação sensorial mínima, e expressamente nenhum estímulo triz.

Deve-se ainda notar que a variação ocasional na estrutura MCA, incluindo a excessiva ramificação, vários segmentos primários, ou a ausência de artérias comunicantes pode ocorrer em uma freqüência de 10 a 30% no sexo masculino adulto Sprague Dawley ^29,30. Se anormalidades na MCA são observados, é aconselhável não usar esse assunto em particular como a adição de animais com tais anomalias vasculares vão aumentar a variabilidade do infarto.

Além disso, há vários aspectos práticos de oprocedimento ur que tornam este método de oclusão vantajoso para a investigação derrame. Em primeiro lugar, as suturas podem ser colocados ao redor da artéria, mas não apertou a fim de recolher a avaliação inicial, seguido de avaliação pós-isquêmica após ligadura e transecção. Nesta forma, a preparação cirúrgica necessária para a oclusão é efectivamente controlada por, entre os indivíduos. Como os indivíduos podem permanecer estacionária ou dentro de um quadro estereotáxico durante a oclusão, é possível realizar uma avaliação experimental de cada sujeito, antes, durante, e após a oclusão, sem mover o objecto ou perturbar qualquer equipamento em uso experimental ^25,28. Além disso, este procedimento resulta em uma taxa de mortalidade muito baixa, mesmo dentro de assuntos roedores idade 21-24 meses de idade (o equivalente a um humano idoso) ^31, e pode, portanto, ser usados ​​para avaliar tratamentos acidente vascular cerebral em ratos que mais de perto o modelo mais comum faixa etária dos portadores de acidente vascular cerebral ^25,28. Vessel transection também serve a vários propósitos práticos. A falta de sangramento depois da transecção confirma que o recipiente foi completamente ocluído em ambos os locais de ligadura. Além disso, transection garante uma interrupção permanente do fluxo de sangue. Finalmente, a transecção assegura que qualquer fluxo de sangue detectado nas porções distais do vaso ocluído deve vir de uma fonte alternativa.

Finalmente, embora especificamente descrever a técnica de oclusão para MCA neste manuscrito e vídeo, a mesma técnica transection ligadura dupla pode ser aplicado a qualquer vaso cerebral que pode ser acessado via craniotomia. O nosso laboratório, por exemplo, utilizado em conjunto com pMCAO várias oclusões adicionais permanentes MCA distais dos ramos, a fim de bloquear tanto primário, e do fluxo de sangue colateral ²⁴ de uma maneira semelhante à das técnicas destinadas a induzir selectivamente isquemia no córtex somatossensorial primário ^32.

Em conclusão, to seu método de oclusão permanente, tal como aplicado a MCA modela estreitamente três facetas primárias de acidente vascular cerebral humano: a localização mais comum (MCA), tipo (isquemia), e grau de dano (enfarte), associada com a literatura clínica humana de acidente vascular cerebral. Além disso, este método de oclusão pode ser aplicada aos locais de oclusão simples ou múltiplo ao longo do cérebro, e pode ser realizado em doentes idosos com uma elevada taxa de sobrevivência. Dada a natureza dinâmica, permanente e relativamente não-invasivo desta oclusão, esta técnica representa uma ferramenta adicional para os pesquisadores pré-clínicos avaliando novas abordagens para a protecção e tratamento de acidente vascular cerebral.

Protocol

1. Introdução: Instrumentos cirúrgicos requeridos Veja a Figura 4 Broca de dentista (Kavo Equipamentos Odontológicos, Modelo: UMXL-TM), 2-broca e furadeira de 3 bits Agulhas hipodérmicas dois ~ calibre 30 Serrilhada pinça, curvo ponta opcional (pode ser útil, mas não essencial) Dois pinça de ponta fina cortadores de fio Fio de sutura Micro tesoura 2. Criando a jan…

Representative Results

Oclusão de sucesso de um navio pode ser confirmado usando laser de salpico de imagem (LSI), entre outras técnicas de imagem do fluxo sanguíneo. O fluxo de sangue nos principais ramos corticais da MCA deve cair para ~ 25% da linha de base ou menos após oclusão, dependendo do nível de ruído no sistema de gravação e a sensibilidade da técnica. Ver Figura 3 para uma imagem representativa de um LSI segmento de um ramo cortical da MCA, antes e após a oclusão MCA. Quando a técnica…

Discussion

Este protocolo foi desenvolvido a fim de induzir isquemia dentro do córtex roedor, e a fazê-lo com o mínimo de impacto periférica sujeitos experimentais. A dupla oclusão e método transecção permite a confirmação visual de que o recipiente foi permanentemente obstruída, e pode ser realizado sem invasão excessiva ou danos no tecido, e com uma elevada taxa de sobrevivência. Este protocolo de oclusão pode ser aplicada a qualquer recipiente cortical que podem ser acedidas através craniotomia para induzir isque…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL