Permanente Cerebrale vatocclusie<em> Via</em> Dubbele Ligatuur en doorsnijding

Summary

We beschrijven een zeer reproduceerbare werkwijze voor de permanente occlusie van een knaagdier grote cerebrale bloedvat. Deze techniek kan worden bereikt met zeer weinig perifere schade minimaal bloedverlies, een hoog percentage overleving op lange termijn en consistente infarct volume evenredig met de klinische populatie.

Abstract

Beroerte is een belangrijke oorzaak van overlijden, invaliditeit, en sociaal-economische schade wereldwijd. De meerderheid van alle beroertes gevolg zijn van een onderbreking van de bloedstroom (ischemie) ^1. Middelste cerebrale slagader (MCA) levert een grote meerderheid van het bloed naar het laterale oppervlak van de cortex ^2, is de meest voorkomende plaats van de menselijke beroerte ^3, en ischemie op zijn grondgebied kan leiden tot uitgebreide disfunctie of dood ^1,4,5. Overlevenden van ischemische beroerte lijden vaak verlies of verstoring van motorische capaciteiten, sensorische gebreken, en infarct. In een poging om deze belangrijke kenmerken van een beroerte vast te leggen, en daarbij effectieve behandeling te ontwikkelen, is een veel nadruk gelegd op dierlijke modellen van ischemie bij MCA.

Hier presenteren we een werkwijze voor het permanent afsluiten van een corticaal oppervlak bloedvat. We zullen deze methode presenteren met behulp van een voorbeeld van een relevante vatocclusie dat modelleert het meest voorkomende type, de locatie, en de uitkome van de menselijke beroerte, permanente midden cerebrale slagader occlusie (pMCAO). In dit model, we chirurgisch MCA bloot in de volwassen rat en vervolgens af te sluiten via dubbele ligatuur en doorsnijding van het schip. Dit pMCAO blokkeert het proximale corticale tak van MCA, waardoor ischemie in alle MCA corticale gebied, een groot deel van de cortex. Deze methode van occlusie kan ook worden gebruikt om meer distale delen van corticale vaartuigen afsluiten om meer focale ischemie gericht op een kleiner gebied van de cortex bereiken. De belangrijkste nadelen van pMCAO zijn dat de chirurgische procedure enigszins invasief kleine craniotomie is nodig voor MCA, maar dit resulteert in minimale weefselbeschadiging. De belangrijkste voordelen van dit model zijn echter: de occlusieplaats goed gedefinieerd, de mate van verminderde doorbloeding is consistent, functioneel en neurologische stoornis treedt snel, infarctgrootte is consistent, en de hoge overleving maakt lange term chronische evaluatie.

Introduction

Om ischemische condities die effectief na te bootsen menselijke ischemische beroerte veroorzaken, worden diverse dierlijke takt modellen op grote schaal toegepast, met wisselende volumes infarct als gevolg. In de fototrombotisch model, de hersenen bestraald door de intacte schedel met laser belichting na intraveneuze injectie van een lichtgevoelige stof (zoals rose-bengal), resulterend in fotochemische coagulatie, verstopping van de bestraalde schepen en ischemie in het omringende weefsel ^{6, 7.} Photothrombosis kunnen zeer kleine, geïsoleerde gebieden van infarct en wordt typisch als een modelmatig "mini-beroerte" of "micro-slagen".

De meer algemeen aanvaarde methode voor het induceren van ischemische beroerte, in het bijzonder middelste cerebrale slagader (MCA), is de intraluminale monofilament model ^8, waarin een filament wordt operatief ingebracht in de uitwendige halsslagader en voortbewogen totdat het uiteinde afsluit basis van MCA. Een primary uitdaging van intraluminale filament occlusie is het hoge sterftecijfer (70% bij MCA wordt afgesloten voor 3 uur, een relevante tijdstip voor slagonderzoek) ^9. Andere problemen met de methode opgenomen mogelijke subarachnoïdale bloeding, onvolledige occlusie, en variabele infarctvolume ^10,11. Dit model resulteert in een uitgebreide mate van infarct zowel in de cortex en Subcortically ^12, en modellen een enorme menselijke beroerte.

Hoewel zowel micro-en zware beroerte modellen zijn belangrijk, menselijk slagen zijn meestal ergens tussenin. In grote klinische studies, beroerte infarct varieert in grootte 28-80 cm ^3, wat zich vertaalt naar 4,5-14% van de ipsi-ishemic halfrond ^9. In vergelijking, onze rat pMCAO infarct grootte varieert van ongeveer 9-35 mm ^3, die 3 tot 12% van de ipsi-ishemic halfrond vormt. Onze pMCAO model, dus sterk lijkt op de menselijke ischemische beroerte infarct volumes op percentage van de hersenenvolume.

Naast het modelleren van de structurele beschadiging van beroerte, pMCAO resulteert in functionele en afwijkend gedrag vergelijkbaar met de menselijke conditie. Op minimum, een effectief model van een beroerte leidt tot tekorten beweging contralateraal aan slagschade ^13-15, verlies of verstoring van motorische en sensorische functie ^16,17, verlies of verstoring van opgewekte neuronale activiteit ^16,18, vermindering van de cerebrale bloeddoorstroming ^{19, 20,} en infarct ^21,22. Dienovereenkomstig, onze pMCAO modellen een ernstige occlusie van de MCA resulteert in lichamelijke handicap, verlies van functie binnen de sensorische cortex (en naburige cortex), verstoring van de neuronale activiteit, een ernstige vermindering van de MCA bloedstroom, en infarct-keurmerk attributen van ischemische beroerte ^{23 -25} daarom dienen als een effectief model van menselijke beroerte.

Procedureel pMCAO gaat om een ​​kleine craniotomie waarin wij verwijder voorzichtig de schedel en dura uiteen 2 x 2 mm "chirurgische venster" via eerste (M1) segment van MCA, net voor de primaire splitsing van MCA in de anterieure en posterieure corticale takken (Figuren 1A en 1B). We passeren een half-bocht achteruit snijden hechtdraad naald en draad (6-0 zijde) door de pial laag van de hersenvliezen, onder MCA en boven de corticale oppervlak (zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur voor de chirurgische leveringen nodig voor het uitvoeren van pMCAO ). We binden dan een dubbele ligatuur, draai de twee knopen rond MCA, en doorsnijden het schip tussen de twee knopen. De dubbele ligatuur en doorsnijding door M1 komt net distaal van de vertakking lenticulostriate, zodanig dat alleen de corticale takken van MCA zijn getroffen-dus alleen corticale infarct (geen subcorticale schade) ontstaat ^26,27 (figuur 2). Hoewel de menselijke beroerte gaat vaak gepaard met subcorticale infarct, het modelleren van deze bij knaagdieren vereist meer invasieve (afsluitende cerebrale bloedvaten vóór corticale Branching vereist toegang slagaders via de halsslagader in de nek en vereist extra afsluitingen) in techniek en verhoogde variabiliteit in infarctgrootte. Het hier beschreven model kan niet meer proximaal worden uitgevoerd als de toegang tot eerdere takken van MCA is niet mogelijk via een eenvoudige craniotomie. Terwijl het chirurgisch mogelijk is om een ​​subcorticale infarct via pMCAO induceren, zou occlusie een zeer invasieve procedure omvat en dus niet ideaal.

Effectiviteit van occlusie kan worden bevestigd via laser Doppler of laser speckle imaging ^12,24,25 (figuur 3), of post-mortem histologisch (Figuur 2). Opgemerkt moet worden dat het vorige onderzoek heeft aangetoond dat sensorische stimulatie een belangrijke rol kan spelen in de evolutie en de uitkomst van infarct; verlening van bescherming tegen beschadiging bij toediening binnen 2 uur van pMCAO en het veroorzaken van een toename van de beroerte schade wanneer toegediend op 3 uur na pMCAO ^24,25,28. Wij hebben bevestigd dat ten 5 uur na pMCAO, stimulatie niet langer invloed heeft op resultaat (ongepubliceerde gegevens). Daarom moet sensorische stimulatie van de proefpersonen worden geminimaliseerd voor 5 uur na pMCAO aan infarct volumes te verkrijgen met minimale variabiliteit. Dienovereenkomstig onze groep heeft "onbehandelde" van dit type door hem ratten verdoofd gedurende 5 uur na pMCAO, in het donker, met minimale sensorische stimulatie en uitdrukkelijk geen whisker stimulatie.

Voorts zij opgemerkt dat af variatie in MCA structuur, waaronder overmatige vertakking, verschillende primaire segmenten, of de afwezigheid van communicatie slagaders optreden met een frequentie van 10 tot 30% in volwassen mannelijke Sprague Dawley ratten ^29,30. Als abnormaliteiten in MCA worden waargenomen, is het raadzaam dat niet specifiek als toevoeging dieren zoals vasculaire abnormaliteiten infarct variabiliteit toenemen.

Daarnaast zijn er verschillende praktische aspecten van our procedure die deze occlusie methode voordelig voor beroerte onderzoek te maken. Ten eerste kunnen hechtingen rond de slagader worden geplaatst zonder aangescherpt om een ​​nulmeting, gevolgd door post-ischemische beoordeling na ligatuur en doorsnijding verzamelen. Op deze wijze wordt chirurgisch preparaat zodat het occlusie effectief gecontroleerd binnen onderwerpen. Omdat patiënten stationair kan blijven of in een stereotaxisch frame in occlusie, is het mogelijk experimentele beoordeling van elk onderwerp voor voeren, tijdens en na occlusie zonder bewegende objecten of experimentele apparatuur storen gebruikt ^25,28. Bovendien, deze procedure resulteert in een zeer lage sterfte, zelfs in oude knaagdier onderwerpen 21-24 maanden (overeenkomend met een oudere mens) ^31, en ​​wordt gebruikt om een beroerte behandelingen bij ratten te evalueren die beter voorspellen van de meest voorkomende leeftijdscategorie van CVA-patiënten ^25,28. Schip transection dient ook een aantal praktische doeleinden. De afwezigheid van bloeden na doorsnijding bevestigt dat het vaartuig volledig werd afgesloten aan beide ligatuur sites. Daarnaast doorsnijding staat doorlopend verstoring van de bloedstroom. Tot slot, doorsnijding zorgt ervoor dat elke bloedstroom gedetecteerd in de distale delen van het afgesloten bloedvat moet komen van een alternatieve bron.

Tenslotte, hoewel wij specifiek beschrijven occlusie techniek MCA in dit manuscript en video, dezelfde dubbele ligatuur doorsnijding techniek kan worden toegepast op elke cerebrale schip dat toegankelijk via craniotomie. Ons laboratorium, bijvoorbeeld pMCAO gebruikt in combinatie met verscheidene bijkomende permanente occlusie van de MCA distale takken om zowel primaire en collaterale bloedstroom ²⁴ blokkeren op een wijze die vergelijkbaar technieken om selectief ischemie induceren in de primaire somatosensorische cortex ^32.

Concluderend, tzijn methode voor permanente occlusie zoals toegepast op MCA nauw modellen drie primaire facetten van het menselijk herseninfarct: de meest voorkomende locatie (MCA), type (ischemie), en de mate van beschadiging (infarct) in verband met de menselijke klinische literatuur van een beroerte. Verder kan deze werkwijze occlusie toegepast op een of meerdere occlusie locaties in de hersenen en kan worden uitgevoerd in oude patiënten met een hoge mate van overleving. Gezien de dynamische, permanente en relatief niet-invasieve karakter van deze occlusie, deze techniek vormt een extra instrument voor preklinische onderzoekers evalueren van nieuwe benaderingen voor de bescherming van en de behandeling van een beroerte.

Protocol

1. Aan de slag: Vereist Chirurgische Instrumenten Zie figuur 4 Tandboor (Kavo Dental Equipment, Model: UMXL-TM), 2-bit boor, en 3-bit boor Twee ~ 30 gauge injectienaalden Getande pincet, gebogen punt optioneel (kan nuttig zijn, maar niet noodzakelijk) Twee fijne punt pincet draadtang Hechtdraad Microscharen 2. Het creëren van de Chirurgische Window Anesthesie…

Representative Results

Succesvolle occlusie van een vat kan worden bevestigd met laser speckle imaging (LSI) onder bloedstroom beeldvormingstechnieken. De bloedstroom in de belangrijkste corticale takken van MCA moet dalen tot ~ 25% van de uitgangswaarde of minder na een occlusie afhankelijk van het niveau van ruis in het opnamesysteem en de gevoeligheid van de techniek. Zie Figuur 3 voor een representatieve LSI beeld van een segment van een corticale tak van MCA voor en na MCA occlusie. Wanneer de occlusie b…

Discussion

Dit protocol werd ontwikkeld om ischemie te induceren binnen het knaagdier cortex, en wel met een minimale impact op perifere proefpersonen. De dubbele occlusie en doorsnijding methode zorgt voor visuele bevestiging dat het schip is definitief afgesloten, en kan worden uitgevoerd zonder overmatige invasie of weefselschade, en met een hoge overlevingskans. Dit occlusie protocol kan worden toegepast op elke corticale vaartuig dat toegankelijk via craniotomie teneinde ischemie bij een bepaalde corticale domein induceren. B…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL