Permanent occlusion des vaisseaux cérébraux<em> Via</em> Double ligature et Transection

Summary

Nous décrivons une méthode hautement reproductible pour l'occlusion permanente d'un important vaisseau sanguin cérébral des rongeurs. Cette technique peut être accompli avec très peu de dommages périphérique, la perte de sang minime, un taux élevé de survie à long terme, et le volume de l'infarctus cohérent en rapport avec la population clinique humaine.

Abstract

L'AVC est une des principales causes de décès, d'invalidité et de perte socio-économiques dans le monde entier. La majorité de tous les AVC causé par une interruption de la circulation sanguine (ischémie) ^1. L'artère cérébrale moyenne (MCA) offre une grande majorité de sang à la surface latérale du cortex ^2, est le site le plus fréquent de l'homme course ^3, et de l'ischémie sur son territoire peut entraîner des dysfonctionnements large ou la mort ^1,4,5. Les survivants d'un AVC ischémique souffrent souvent la perte ou la perturbation des capacités motrices, déficits sensoriels, et l'infarctus. Dans un effort pour capturer ces caractéristiques clés de la course, et ainsi développer un traitement efficace, beaucoup d'accent est mis sur des modèles animaux d'ischémie à MCA.

Nous présentons ici une méthode d'occlusion permanente d'un vaisseau sanguin de la surface corticale. Nous allons présenter cette méthode en utilisant un exemple d'une occlusion du vaisseau pertinente qui modélise le type le plus commun, l'emplacement et outcome de la course humaine, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne permanent (pMCAO). Dans ce modèle, nous exposons chirurgicalement MCA chez le rat adulte et obturer ensuite par un double ligature et la section transversale du navire. Cette pMCAO bloque la branche corticale proximale du MCA, provoquant une ischémie dans tous MCA territoire cortical, une grande partie du cortex. Cette méthode d'occlusion peut également être utilisé pour occlure des portions plus distales des vaisseaux corticaux pour obtenir une ischémie focale plus ciblant une région inférieure du cortex. Les principaux inconvénients de pMCAO sont que l'intervention chirurgicale est peu invasive comme une petite craniotomie est nécessaire pour accéder MCA, même si cela entraîne des lésions tissulaires minimes. Les principaux avantages de ce modèle, cependant, sont les suivants: le site de l'occlusion est bien définie, le degré de réduction du flux sanguin est cohérent, fonctionnel et neurologique dépréciation se produit rapidement, taille de l'infarctus est cohérent, et le taux élevé de survie permet de long évaluation chronique à long terme.

Introduction

Afin d'induire des conditions ischémiques qui imitent efficacement AVC ischémique humaine, plusieurs modèles de course d'animaux sont largement utilisés, avec des volumes d'infarctus résultant divers. Dans le modèle photothrombotic, le cerveau est irradiée à travers le crâne intact utilisant un éclairage laser après l'injection intraveineuse d'une substance photosensible (par exemple, de rose bengale), conduisant à la coagulation photochimique, l'obstruction des vaisseaux irradiées, et de l'ischémie dans le tissu environnant ^{6, 7.} Photothrombosis peut entraîner des très petites régions isolées de l'infarctus et est généralement utilisé comme un moyen de modélisation «mini-AVC», ou «micro-AVC».

La technique plus largement adoptée pour induire un AVC ischémique, en particulier dans l'artère cérébrale moyenne (MCA), est le modèle de monofilament intraluminal ^8, dans lequel un filament est introduit par voie chirurgicale dans l'artère carotide externe et s'avança jusqu'à la pointe obture la base du MCA. A primary défi de l'occlusion intraluminale de filament est le taux de mortalité élevé (70% lorsque MCA est obstruée pendant 3 heures, un point de temps pertinente pour les accidents vasculaires cérébraux) ^9. Autres problèmes avec la méthode incluses possible hémorragie méningée, occlusion incomplète, et le volume de l'infarctus variable de ^10,11. Ce modèle mène à un diplôme étendue de l'infarctus à la fois dans le cortex et subcortically ^12, et des modèles d'un accident vasculaire cérébral humain énorme.

Bien que les modèles à la fois micro et massive AVC sont importantes, coups droits sont généralement quelque part entre les deux. Dans les grandes études cliniques, le temps varie d'infarctus dans la taille 28 à 80 cm ^3, ce qui correspond à 4,5 à 14% de l'IPSI ishemic hémisphère ^9. En comparaison, nos rats pMCAO infarctus taille varie entre environ 9-35 mm ^3, ce qui constitue 3 à 12% de l'hémisphère IPSI ishemic. Notre modèle pMCAO, donc, ressemble étroitement volumes d'infarctus AVC ischémique humaines en pourcentage du cerveauvolume.

En plus de la modélisation des dommages structurels des accidents vasculaires cérébraux, les résultats pMCAO des déficits fonctionnels et comportementaux similaires à la condition humaine. Au minimum, un modèle efficace de résultats AVC chez les déficits de mouvement controlatéral à un accident vasculaire ^13-15, la perte ou la perturbation des fonctions motrices et sensorielles ^16,17, la perte ou la perturbation de l'activité neuronale évoquée ^16,18, réduction du débit sanguin cérébral ^{19, 20, 21,22} et infarctus. En conséquence, nos modèles pMCAO une occlusion grave de MCA entraînant une invalidité physique, la perte de fonction au sein du cortex sensoriel (et cortex voisins), la perturbation de l'activité neuronale, une forte réduction du débit sanguin MCA, et les attributs de l'infarctus cachet d'accident vasculaire cérébral ischémique ^{23 -25,} donc de servir comme un modèle efficace d'accident vasculaire cérébral humain.

Procédural, pMCAO implique une petite craniotomie dans lequel on enlève soigneusement le crâne et la dure deun x mm "fenêtre chirurgical" 2 2-dessus du segment initial (M1) de MCA, juste avant la bifurcation primaire de MCA dans les branches corticales antérieure et postérieure (figures 1A et 1B). Nous passons une demi-courbe inverse de coupe aiguille de suture et le fil (6-0 soie) à travers la couche pial des méninges, MCA-dessous et au-dessus de la surface corticale (voir le tableau de réactifs et d'équipements spécifiques pour les fournitures chirurgicales nécessaires pour mener à bien pMCAO ). Nous attachons donc une double ligature, serrez les deux noeuds autour de MCA, et sectionner le navire entre les deux nœuds. Le double ligature et résection par M1 commence juste en aval de la ramification lenticulostriées, de sorte que seules les branches corticales du MCA sont touchés-ainsi que l'infarctus cortical (aucun dégât sous-corticales) survient ^26,27 (Figure 2). Bien course humaine implique souvent des infarctus sous-corticaux, la modélisation de cette augmentation chez les rongeurs nécessite invasif (occlusion vaisseaux cérébraux avant cortical Branching nécessite artères accès via l'artère carotide dans le cou et nécessite occlusions supplémentaires) dans la technique et de la variabilité accrue dans taille de l'infarctus. Le modèle décrit ici ne peut être effectuée plus proximale que l'accès aux branches antérieures de MCA n'est pas possible via un simple craniotomie. Bien qu'il puisse être chirurgicalement possible d'induire un infarctus sous-corticaux via pMCAO, occlusion impliquerait une procédure extrêmement invasive et n'est donc pas idéal.

Efficacité de l'occlusion peut être confirmée par laser Doppler, ou granularité laser imagerie ^12,24,25 (Figure 3), ou histologique post-mortem (Figure 2). Il convient de noter que les recherches antérieures ont montré que la stimulation sensorielle peut jouer un rôle majeur dans l'évolution et l'issue de l'infarctus, conférant une protection contre les dommages lorsqu'il est administré dans les 2 heures de pMCAO et provoquant une augmentation des dommages course lorsqu'il est administré à 3 heures après pMCAO ^24,25,28. Nous avons confirmé que, à 5 h post-pMCAO, la stimulation n'a plus d'effet sur les résultats (données non publiées). Par conséquent, la stimulation sensorielle des sujets doit être minimisée pendant 5 heures après pMCAO pour obtenir volumes d'infarctus avec une variabilité minimale. En conséquence, notre groupe va «témoins non traités" de ce type en gardant rats anesthésiés pendant 5 heures post-pMCAO, dans l'obscurité, avec minimum de stimulation sensorielle, et expressément aucune stimulation des moustaches.

Il convient également de noter que la variation occasionnelle dans la structure MCA, y compris une ramification excessive, plusieurs segments primaires, ou de l'absence d'artères communicantes peut se produire à une fréquence de 10 à 30% chez les adultes mâles Sprague Dawley ^29,30. Si des anomalies sont observées MCA, il est conseillé de ne pas utiliser ce sujet particulier que l'ajout d'animaux avec de telles anomalies vasculaires va augmenter la variabilité infarctus.

En outre, il ya plusieurs aspects pratiques de l'our procédure qui rendent cette méthode d'occlusion avantageux pour enquête accident vasculaire cérébral. D'abord, les sutures peuvent être placées autour de l'artère, mais pas serrés afin de recueillir une évaluation de base, suivie par une évaluation post-ischémique après ligature et résection. De cette manière, la préparation chirurgicale nécessaire pour l'occlusion est effectivement contrôlé pour, au sein sujets. Parce que les sujets peuvent rester stationnaire ou dans un cadre stéréotaxique tout au long de l'occlusion, il est possible de procéder à une évaluation expérimentale de chaque sujet avant, pendant, et après occlusion sans déplacer l'objet ou de déranger l'équipement expérimental utilisé ^25,28. En outre, cette procédure aboutit à un taux de mortalité très faible, même à l'intérieur de rongeurs sujets âgés 21-24 mois (équivalent à un homme âgé) ^31, et peuvent donc être utilisés pour évaluer les traitements de l'AVC chez les rats qui modèle plus étroitement la plus courante tranche d'âge des personnes atteintes d'AVC ^25,28. Navire transection sert également plusieurs fins pratiques. L'absence de saignement après une section confirme que le navire a été complètement occulté dans les deux sites de ligature. En outre, transsection assure une interruption permanente de l'écoulement sanguin. Enfin, transsection garantit que tout le débit sanguin détectées dans les parties distales du vaisseau occlus doit provenir d'une autre source.

Enfin, bien que nous décrivons précisément cette technique d'occlusion pour le MCA dans ce manuscrit et de la vidéo, la même technique de résection double ligature peut être appliquée à n'importe quel vaisseau cérébral qui peut être accessible via une craniotomie. Notre laboratoire, par exemple, utilisé pMCAO en collaboration avec plusieurs occlusions permanents supplémentaires de branches MCA distales afin de bloquer à la fois primaire et garanties flux sanguin ²⁴ de manière à s'apparente aux techniques destinées à induire sélectivement l'ischémie dans le cortex somatosensoriel primaire ^32.

En conclusion, tsa méthode pour occlusion permanente appliquée à MCA modélise étroitement trois facettes primaire de l'AVC ischémique humain: la localisation la plus fréquente (MCA), le type (ischémie), et le degré de dommage (infarctus) associé à la littérature clinique humain de course. En outre, cette méthode d'occlusion peut être appliquée à des sites d'occlusion simples ou multiples dans le cerveau, et peut être effectuée chez les sujets âgés avec un taux élevé de survie. Compte tenu de la nature dynamique, permanente et relativement non invasive de cette occlusion, cette technique représente un outil supplémentaire pour les chercheurs précliniques évaluer de nouvelles approches pour la protection et de traitement de l'AVC.

Protocol

1. Mise en route: Obligation Instruments chirurgicaux Voir Figure 4 Fraise dentaire (KaVo Dental Equipment, Modèle: UMXL-TM), 2-foret et foret 3-bit Aiguilles hypodermiques Two ~ 30 gauge Dentelé pincettes, courbé pointe en option (peut être utile mais pas indispensable) Deux pinces à pointe fine coupe-fil fil de suture Micro ciseaux 2. Création de la fenêtre chirur…

Representative Results

Succès occlusion d'un vaisseau peut être confirmé en utilisant granularité laser d'imagerie (LSI) parmi d'autres techniques d'imagerie du flux sanguin. La circulation du sang dans les principales branches corticales du MCA devrait tomber à environ 25% du niveau de référence ou occlusion moins suivante en fonction du niveau de bruit dans le système d'enregistrement et la sensibilité de la technique. Voir Figure 3 pour une image représentant LSI d'un segm…

Discussion

Ce protocole a été développé afin d'induire une ischémie dans le cortex des rongeurs, et de le faire avec un impact minimal périphérique de sujets expérimentaux. Le double occlusion et la méthode de résection permet la confirmation visuelle que le navire a été occultée en permanence et peuvent être effectuées sans invasion excessive ou des dommages aux tissus, et avec un taux de survie élevé. Ce protocole occlusion peut être appliquée à tout navire corticale qui peut être accessible via une cran…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL