Un protocole d'induction génétique et visualisation des tumeurs bénignes et envahissantes dans céphalique Complexes de<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
La coopération entre un oncogène RAS activé comme V12 et des mutations dans les gènes de polarité cellulaire comme bourrée, à provoquer une croissance de la tumeur chez la drosophile, où les cellules tumorales présentent également des comportements invasives. Voici un protocole simple pour l'induction et l'observation des tumeurs bénignes et envahissantes est présenté.
Abstract
Drosophila a éclairé notre compréhension de la base génétique du développement normal et la maladie au cours des dernières décennies et aujourd'hui, il continue de contribuer énormément à notre compréhension des maladies complexes 1-7. La progression des tumeurs d'une bénigne à un état métastatique est un événement complexe 8 et a été modélisée chez la drosophile pour nous aider à mieux comprendre la base génétique de cette maladie 9. Ici, je présente un protocole simple pour induire génétiquement, observer et ensuite analyser la progression des tumeurs chez les larves de drosophile. La technique d'induction des tumeurs est basé sur le système de marcm 10 et exploite la coopération entre un oncogène activé, Ras V12 et la perte de gènes de polarité de la cellule (bourrée, et des disques à grande létale larves de géant) pour générer des tumeurs invasives 9. Je démontre comment ces tumeurs peuvent être visualisées dans les larves intactes etcomment ceux-ci peuvent être disséqués pour une analyse ultérieure. Le protocole simplifié présenté ici devrait permettre à cette technique pour être utilisé par les chercheurs intéressés à comprendre le rôle d'un gène dans l'invasion tumorale.
Introduction
La progression des tumeurs d'une bénigne à un état métastatique est un processus de sage étape qui se caractérise par l'évasion de mécanismes protecteurs présents dans le corps 8. Par exemple les cellules tumorales dans le corps doivent être en mesure d'échapper à l'apoptose et le système immunitaire, la percée de la matrice extracellulaire spécialisée (ECM) appelée membrane basale, et de surmonter tous les contrôles sociaux imposés par les cellules environnantes 8. C'est grâce à une progression pas à pas sage que les cellules cancéreuses acquièrent la capacité de migrer et de coloniser des sites distants dans un processus appelé métastase. Notre compréhension de la façon dont la cellule tumorale surmonte les barrières imposées par le corps est encore à ses balbutiements, cependant, l'image qui émerge de la recherche effectuée points ainsi loin d'une utilisation répétée des processus normaux de développement et des voies de signalisation par les cellules cancéreuses 11-13.
La mouche des fruits Drosophila melanogaster a énormément contribué à notre understanding du développement normal et la maladie par l'utilisation de techniques génétiques sophistiquées développées au cours des dernières décennies 14-17. En utilisant la mutagenèse et les outils de surexpression nous sommes arrivés à une meilleure compréhension des différents oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs 18-22. Cependant, les métastases de la tumeur est le résultat d'une coopération entre plusieurs lésions génétiques qui ont été étudiés principalement dans des modèles de culture de cellules 23,24, ainsi que différents modèles de xénogreffe 25-27. Ces modèles quoique puissante ont leurs limites car ils ne reproduisent pas entièrement aux conditions énoncées dans un organisme vivant. En outre, les modèles transgéniques disponibles chez la souris sont encombrants et peu propice à l'analyse génétique de comportement invasif 28,29. Plusieurs études ont tenté de comprendre l'invasion des cellules tumorales chez la drosophile 30,31. Ces techniques utilisent principalement la transplantation de tumeurs primaires aux hôtes et reposent sur le suivi de la tratumeurs nsplanted pour invasion des tissus voisins 32,33. Une technique puissante appelée marcm 10 a été adapté par Pagliarini et Xu pour modéliser l'invasion tumorale chez la drosophile 9. Cette modélisation élégante génétique de l'invasion tumorale a exploité la coopération entre un oncogène activé et la perte de la polarité cellulaire. La puissance de cette modélisation réside dans le fait que les tumeurs invasives sont créés dans un organisme intact contournant ainsi le besoin d'une transplantation de tissus. Pour provoquer la coopération oncogène, un oncogène Ras activé comme V12 est exprimée dans les clones de cellules dans le disque d'eye-antennaire larvaire. En raison de la technique de marcm ces clones sont également marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP) pour une visualisation facile et sont publiés homozygotes pour les mutants de la polarité de la cellule tels que les larves létale géant, bourrée, et des disques de grandes. Résulte GFP étiqueté tumeurs invasives dans l' complexe céphalique. Dans ce rapport, jedémontrer comment provoquer, et de visualiser ces tumeurs invasives à la fois dans le cadre d'une larve intact et dans disséquée complexe céphalique. L'induction de tumeurs présentée ici utilise des réactifs sur le deuxième chromosome de Drosophila. Dans le tableau 2, je fournis une liste de stocks sur X et 3 e chromosomes qui peuvent être utilisés dans le même but. Je crois que ce protocole simplifié fera cette technique facilement accessibles aux chercheurs qui s'intéressent à la compréhension de la base moléculaire de la progression tumorale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cancer est une maladie complexe avec une bien meilleure compréhension aujourd'hui que dans le passé. Cependant, il reste encore beaucoup à apprendre et expliqué avant que nous ayons une image complète des mécanismes sous-jacents. Le protocole simple présenté ici, il est possible d'induire des tumeurs bénignes et génétiquement invasives dans un organisme entier, puis l'étude de la biologie associée à la progression des tumeurs dans ce modèle. La plupart des techniques existantes de Droso…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche dans mon laboratoire est soutenu par le Département WKU des fonds de démarrage de biologie, WKU Fondation de la recherche de la CRPA-je accorder # 11-8032 et par une subvention KBRIN-ZONE financé grâce à une subvention de parent de l'Institut national de sciences médicales générales des National Institutes de la Santé sous le numéro d'attribution 5P20GM103436-13. Je tiens également à remercier le Dr Tian Xu dans le laboratoire duquel j'ai été présenté à cette technique et le Dr Raymond Pagliarini qui le premier a créé cette technique dans le laboratoire Xu.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
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