Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS ^V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.

Abstract

Drosophila ha illuminato la nostra comprensione della base genetica dello sviluppo normale e malattia negli ultimi decenni e oggi si continua a contribuire enormemente alla nostra comprensione di malattie complesse ^1-7. Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un evento complesso ⁸ ed è stato modellato in Drosophila per aiutarci a capire meglio la base genetica di questa malattia ^9. Qui vi presento un semplice protocollo per indurre geneticamente, osservare e quindi analizzare la progressione dei tumori in Drosophila larve. La tecnica di induzione tumorale si basa sul sistema marcm ¹⁰ e sfrutta la cooperazione tra un oncogene attivato, Ras ^V12 e perdita di geni polarità cellulare (intima, dischi grandi e letale larve gigante) per generare tumori invasivi ^9. I dimostrare come questi tumori possono essere visualizzati nelle larve intatto epoi come queste possono essere sezionati per ulteriori analisi. Il protocollo semplificato qui presentato dovrebbe consentire di questa tecnica per essere utilizzato da ricercatori interessati a comprendere il ruolo di un gene in invasione tumorale.

Introduction

Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un processo passo saggio che si caratterizza per l'evasione di meccanismi protettivi presenti nel corpo ^8. Per esempio le cellule tumorali nel corpo deve essere in grado di eludere l'apoptosi e il sistema immunitario, sfondamento della matrice extracellulare specializzata (ECM) chiamato membrana basale, e superare eventuali controlli sociali imposti dalle cellule circostanti ^8. E 'attraverso un saggio passo progressione che le cellule tumorali acquisiscono la capacità di migrare e colonizzare siti distanti in un processo chiamato metastasi. La nostra comprensione di come la cellula tumorale supera le barriere imposte dal corpo è ancora nella sua infanzia, tuttavia, il quadro che emerge dalla ricerca effettuata punti sinora per un uso ripetuto di processi di sviluppo normali e vie di segnalazione da parte delle cellule tumorali ^11-13.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster ha contribuito enormemente alla nostra understanding del normale sviluppo e della malattia attraverso l'uso di sofisticate tecniche genetiche sviluppate nel corso degli ultimi decenni ^14-17. Utilizzo di mutagenesi e gli strumenti iperespressione siamo arrivati ​​ad una migliore comprensione dei diversi oncogeni e geni oncosoppressori ^18-22. Tuttavia, la metastasi del tumore è il risultato della cooperazione tra diverse lesioni genetiche che è stato studiato principalmente in modelli di coltura cellulare ^23,24 così come i vari modelli di xenotrapianto ^25-27. Questi modelli però potente presentano dei limiti per quanto non simulare perfettamente le condizioni trovate in un organismo vivente. Inoltre, i modelli transgenici disponibili nei topi sono ingombranti e non favorevole alla analisi genetica del comportamento invasivo ^28,29. Diversi studi hanno cercato di capire invasione delle cellule tumorali in Drosophila ^30,31. Queste tecniche utilizzano principalmente trapianto di tumori primari agli host e poi si basano sul monitoraggio del TRAI tumori nsplanted per l'invasione dei tessuti circostanti ^32,33. Una tecnica potente chiamato marcm ¹⁰ è stato adattato da Pagliarini e Xu modellare l'invasione del tumore in Drosophila ^9. Questa elegante modellazione genetica di invasione tumorale sfruttata la cooperazione tra un oncogene attivato e la perdita della polarità cellulare. La potenza di questa modellazione sta nel fatto che i tumori invasivi sono creati in un organismo intatto eludendo così la necessità di trapianti di tessuti. Per realizzare la cooperazione oncogeno, un oncogene attivato come Ras ^V12 è espresso in cloni di cellule nel disco occhio-antenne larvale. Come risultato della tecnica marcm questi cloni sono contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e sono fatti mutanti omozigoti per polarità cellulare come letale larve gigante, intima, e dischi grandi. Il risultato è GFP etichettato tumori invasivi nella complesso cefalica. In questa relazione hodimostrare come indurre, e visualizzare questi tumori invasivi sia nel contesto di un larve intatta e sezionato fuori complesso cefalica. L'induzione del tumore qui presentato utilizza reagenti sul secondo cromosoma di Drosophila. Nella Tabella 2, fornisco una lista di titoli su X e ³ ° cromosomi che possono essere utilizzati per lo stesso scopo. Credo che questo protocollo semplificato renderà questa tecnica facilmente accessibile ai ricercatori interessati a comprendere le basi molecolari della progressione tumorale.

Protocol

1. L'induzione di tumori benigni non invasivi Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori benigni. Preparare una coltura starter per lo stock "tester" del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO Raccogliere dieci verg…

Representative Results

Come risultato del protocollo presentato qui l'utente sarà in grado di indurre tumori benigni sovraesprimendo un oncogene attivato nel larvale occhio antennal disco immaginale. L'utente sarà anche in grado di indurre tumori invasivi nel disco antennal occhio sovraesprimendo un oncogene attivato al cloni di cellule mutanti anche per un gene polarità cellulare. I tumori possono essere facilmente visualizzati con l'aiuto di uno stereomicroscopio a fluorescenza come tessuto "fluorescente verde" in t…

Discussion

Il cancro è una malattia complessa con una comprensione molto migliore oggi rispetto al passato. Tuttavia, resta ancora molto da imparare e spiegato prima abbiamo un quadro completo dei meccanismi alla base. Il semplice protocollo qui presentato permette di indurre geneticamente tumori benigni e invasivi in ​​un intero organismo e poi studiare la biologia associata alla progressione dei tumori in questo modello. La maggior parte delle tecniche esistenti in Drosophila e altri organismi o utilizzano un siste…

Materials

10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution	Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution	Invitrogen, Sigma Aldrich		Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap	Carolina Biologicals		Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative	0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde		Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket	Several		Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube	Various
Glass slides, cover glass	Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media	Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil	Polysciences Inc. or Halocarbon.com		Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish	Can be found at any general merchandise store		Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope	Leica and others		Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish	Sigma Aldrich
Paint Brush	Can be found at any general merchandise store
			Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.