Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
RAS V12 ve karalanmış, tümör hücreleri de invaziv davranışlar sergileyen Drosophila tümör büyüme neden gibi hücre polarite genlerindeki mutasyonlar gibi bir aktive onkogen arasındaki işbirliği. Burada iyi huylu ve invaziv tümörlerin indüksiyon ve gözlem için basit bir protokol verilmektedir.
Abstract
Drosophila karmaşık hastalıkların 1-7 anlamamıza büyük katkı devam ediyor son birkaç yıldır ve bugün için normal gelişim ve hastalığın genetik temeli anlayışımızı aydınlatmıştır. Bir metastatik duruma iyi huylu tümörlerin ilerlemesi karmaşık bir olay 8 ve bizi daha iyi bu hastalığın 9 genetik temelini anlamak için Drosophila modellenmiştir. Burada genetik, neden gözlemlemek ve sonra Drosophila larvaları tümörlerin ilerlemesini analiz etmek için basit bir protokol mevcut. Tümör indüksiyon tekniği MARCM 10 sistemi tabanlı ve aktif bir onkogen, Ras V12 ve hücre polarite genlerinin kaybı (karalanmış, diskler büyük ve ölümcül dev larva) invaziv tümörleri 9 üretmek arasındaki işbirliğini patlatır edilir. Ben bu tümörler sağlam larvaları görüntülendi olabilir nasıl göstermek veo zaman nasıl bu daha fazla analiz için dışarı disseke edilebilir. Burada sunulan basitleştirilmiş protokolü mümkün bu tekniğin tümör işgali bir genin rolünü anlamak isteyen araştırmacılar tarafından kullanılmak için yapmalıdır.
Introduction
Metastatik bir duruma bir iyi huylu tümörlerin ilerlemesi gövde 8 içinde mevcut koruyucu mekanizmaların kaçırma ile karakterize aşamalı bir işlemdir. Örneğin, vücut, tümör hücrelerinin, apoptoz ve bağışıklık sistemini kaçmasına Bazal Membran olarak adlandırılan özel bir hücre dışı matrisi (ECM) atılım ve çevredeki hücrelerin 8 tarafından uygulanan herhangi bir sosyal kontrol aşmak gerekir. Bu kanser hücreleri metastaz denilen bir süreçte uzak siteleri göç ve kolonize yeteneğini kazanmış bir adım akıllıca ilerlemesi geçer. Tümör hücresi vücut tarafından dayatılan engellerin üstesinden nasıl anlayışımız, ancak araştırma ortaya çıkan resim kanser hücreleri 11-13 normal gelişim süreçleri ve sinyal yollarının tekrar tekrar kullanılması bugüne kadar puan yapmış, hala emekleme döneminde olduğunu.
Meyve Drosophila melanogaster bizim und müthiş katkıda bulunmuştur uçmakSon birkaç on yıl boyunca 14-17 geliştirmiştir gelişmiş genetik tekniklerin kullanımı ile normal büyüme ve gelişme hastalığı erstanding. Biz çeşitli onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerin 18-22 daha iyi anlaşılması ulaştık mutajenizi ve ekspresyonu araçlarını kullanma. Bununla birlikte, tümör metastazı hücre kültürü modelleri 23,24 yanı sıra çeşitli ksenograft modelleri 25-27 temel olarak incelenmiştir çeşitli genetik lezyonlar arasındaki işbirliğinin bir sonucudur. Bunlar tamamen canlı bir organizmada bulunan koşullarını taklit yok gibi, bu modellerin güçlü olsa sınırlamaları var. Ayrıca, farelerde mevcut transgenik modeller hantal ve invaziv davranış 28,29 genetik analizi için elverişli değildir. Çeşitli çalışmalar Drosophila 30,31 tümör hücrelerinin işgali anlamaya çalıştılar. Bu teknikler öncelikle hosts birincil tümörlerin nakli kullanmak ve sonra tra izleme güveniyorkomşu dokuların 32,33 işgali için tümörleri nsplanted. MARCM 10 denilen güçlü bir tekniktir Drosophila 9 tümör işgali model Pagliarini ve Xu tarafından uyarlandı. Invazyon Bu zarif genetik modelleme bir aktive onkogen ve hücre polarite kaybı arasındaki işbirliğini kullandı. Bu modelleme gücü istilacı tümör böylece dokuların nakli ihtiyacını engellemeyi sağlam bir organizma içinde oluşturulan gerçeğinde yatmaktadır. Onkojenik işbirliği meydana getirmek için, Ras V12 gibi aktive edilmiş bir onkogen larva göz antennal disk hücre klonlarının ifade edilir. MARCM tekniğin bir sonucu olarak, bu klonlar, aynı zamanda kolay görselleştirme için yeşil floresan protein (GFP) ile işaretlenmiştir ve dev larva öldürücü, karalanmış ve büyük diskler gibi cep kutup mutantlar için homozigot yapılır. Sonuç GFP invaziv tümörleri olan etiketli sefalik karmaşık. Bu raporda Iikna etmek için nasıl göstermek ve sağlam bir larva bağlamında ve dışarı disseke sefalik kompleksi hem bu invaziv tümörleri görselleştirmek. Burada sunulan tümör indüksiyonu Drosophila ikinci kromozomu üzerinde reaktif kullanır. Tablo 2 de, aynı amaç için kullanılabilir X ve 3. kromozomlar üzerine stokların bir listesini sağlar. Bu basitleştirilmiş bir protokol progresyonla moleküler temelini anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği kolayca erişilebilir hale getireceğine inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser geçmişte çok daha iyi bir anlayış bugün karmaşık bir hastalıktır. Ancak, hala çok öğrendim ve biz altında yatan mekanizmaları tam bir resim var önce açıklanması gerekir. Burada sunulan basit bir protokol mümkün genetik olarak bütün bir organizma içinde iyi huylu ve invaziv tümörleri neden ve bu modelde, tümör ilerlemesi ile ilişkili biyoloji çalışma kolaylaştırır. Drosophila ve diğer organizmalarda mevcut tekniklerin çoğu tümörogenez ve metastazı veya 23-27</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Benim Araştırma laboratuvarında Biyoloji başlangıç fonları WKU Bölümü, WKU Araştırma Vakfı RCAP-I # 11-8032 hibe tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü'nden bir ana hibe ile finanse edilen bir KBRIN-ALAN hibe Sağlık ödül sayısı 5P20GM103436-13 altında. Ben ayrıca, laboratuvar ilk Xu laboratuvarda bu tekniği kurulan bu tekniği ve Dr Raymond Pagliarini tanıtıldı Dr Tian Xu içinde kabul etmek istiyorum.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
Riferimenti
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetica. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetica. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetica. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
