遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル<em>キイロショウジョウバエ</em
Summary
RAS V12と走り書き 、腫瘍細胞はまた、侵襲性の挙動を表示するショウジョウバエにおける腫瘍増殖をもたらす様細胞極性遺伝子の突然変異のような活性化癌遺伝子間の協力。ここに良性および浸潤性腫瘍の誘導および観察のための単純なプロトコルが提示される。
Abstract
ショウジョウバエは、過去数十年の間、通常の開発や病気の遺伝的基礎の理解を照らしており、今日では、複雑な疾患1-7の我々の理解に非常に貢献し続けています。転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、複雑なイベント8で、私たちはより良いこの病気9の遺伝的基礎を理解するために、ショウジョウバエでモデル化されています。ここで私は、遺伝的に誘導し、観察した後、 ショウジョウバエの幼虫の腫瘍の進行を分析するための単純なプロトコルを提示する。腫瘍誘発技術はMARCMシステム10に基づいており、活性化癌遺伝子、RasのV12及び細胞極性遺伝子の損失（ 落書き 、 ディスク大きく 、 致死巨大幼虫 ）浸潤性腫瘍9を生成する間の連携を利用している。私は、これらの腫瘍は完全な幼虫で可視化することができる方法を紹介し、次に、どのようにこれらは、さらなる分析のために切開することができます。ここで紹介する単純化したプロトコルにより、この技術は腫瘍の浸潤における遺伝子の役割を理解することに興味の研究者によって利用されるのを確認する必要があります。
Introduction
転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、本体8に存在する防御機構の回避することを特徴とする段階的なプロセスです。例えば、体内の腫瘍細胞は、アポトーシスや免疫システムを回避する基底膜と呼ばれる特殊な細胞外マトリックス（ECM）を突破し、周囲の細胞8が課す社会的コントロールを克服できなければなりません。これは、がん細胞が転移と呼ばれるプロセスでの遠隔部位に移行し、コロニーを形成する能力を獲得という段階的進行を介して行われます。腫瘍細胞は、体によって課さ障壁を克服する方法についての我々の理解は、しかし、研究から出てくる写真は、癌細胞による正常な発生過程およびシグナル伝達経路の繰り返し使用11月13日にこれまでのポイントを行って、まだ始まったばかりである。
フルーツ飛ぶキイロショウジョウバエは、私たちのウントに途方もなく貢献してきました過去数十年の14〜17にわたって開発、洗練された遺伝学的技術を用いて正常な発達と病気のerstanding。我々は、様々な癌遺伝子および癌抑制遺伝子18〜22歳のより良い理解に到達した突然変異誘発および過剰発現のツールを使用して。しかしながら、腫瘍転移は、細胞培養モデル23,24ならびに種々の異種移植モデル25-27主に研究されているいくつかの遺伝子病変間の協力の結果である。それらは完全に生体に見られる条件を模倣しないように、これらのモデルは、強力なしかし、それらの限界がある。さらに、マウスでの利用可能なトランスジェニックモデルが面倒で、侵襲性行動28,29の遺伝子解析に資するものではない。いくつかの研究は、ショウジョウバエ 30,31における腫瘍細胞の浸潤を理解しようと試みてきた。これらの技術は、主にホストに原発性腫瘍の移植を利用して、TRAの追跡に依存している隣接組織32,33の侵入のために腫瘍をnsplanted。 MARCM 10と呼ばれる強力な技術は、ショウジョウバエ 9に腫瘍の浸潤をモデル化するためにPagliariniと徐により適応されました。腫瘍の浸潤のエレガントな遺伝的モデル化は、活性化癌遺伝子や細胞極性の喪失との連携を悪用。このモデル化のパワーは浸潤性腫瘍は、したがって組織の移植のための必要性を回避無傷の生物に作成されるという事実にある。発癌の協力をもたらすために、RasのV12のような活性化癌遺伝子は、幼虫の目を触角にある細胞のクローンで表されます。 MARCM技術の結果、これらのクローンはまた、簡単に視覚化のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）が付いていますし、細胞極性の走り書き致死巨大な幼虫のような変異体、および大規模なディスクのためにホモ接合作られています。結果がで浸潤性の腫瘍を、GFPをタグ付けされている頭部複雑。本報告では、私誘導し、無傷の幼虫のコンテキストでかつ摘出頭部複合体の両方で、これらの浸潤性腫瘍を可視化する方法を示します。ここで紹介する腫瘍誘導はショウジョウバエの第二の染色体上の試薬 を利用しています。 表2には、私は同じ目的のために利用することができ、Xおよび第 3染色体上の株式のリストを提供する。私はこの単純化されたプロトコルは、腫瘍の進行の分子基盤を理解することに興味を持って研究者にこの技術は容易にアクセスできるようにと考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
癌は過去に比べてはるかに優れた理解、今日と複雑な疾患である。しかし、まだ多くを学んだし、我々は根本的なメカニズムの全体像を持って前に説明される必要がある。ここで紹介する単純なプロトコルは、遺伝的、生物全体に良性および浸潤性腫瘍を誘発し、このモデルでは腫瘍の進行に関連した生物学を研究することが可能となる。 ショウジョウバエにおける既存の技術および…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私の研究室での研究はWKU研究財団RCAPは-Iは、生物学のスタートアップ資金のWKU省によってサポートされている＃11から8032を付与し、国民の協会の総合医科学研究所から親の許可によって資金を供給KBRINエリア助成金健康の賞番号5P20GM103436-13アンダー。私はまた、その実験室の私が最初に徐実験室で、この手法を確立し、この技術博士レイモンドPagliariniに導入された博士ティアン徐を承認したいと思います。
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
Riferimenti
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetica. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetica. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetica. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
