Ein Protokoll für genetische Induktion und Visualisierung von Gut-und invasiven Tumoren in Cephalic Komplexe von<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen RAS wie ^V12 und Mutationen in Genen, die Zellpolarität wie gekritzelt, führen in das Tumorwachstum in Drosophila, wo Tumorzellen invasive Verhalten zeigen auch. Hier wird ein einfaches Protokoll für die Induktion und Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren präsentiert.

Abstract

Drosophila hat unser Verständnis der genetischen Grundlagen der normalen Entwicklung und Krankheit in den letzten Jahrzehnten und heute immens zu unserem Verständnis der komplexen Krankheiten beitragen ^07.01 geht es weiter beleuchtet. Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein komplexes Ereignis ⁸ und hat in Drosophila modelliert worden, um uns helfen, die genetischen Grundlagen der Erkrankung ⁹ besser zu verstehen. Hier stelle ich ein einfaches Protokoll, genetisch zu induzieren, beobachten und analysieren dann die Progression von Tumoren in Drosophila-Larven. Die Tumorinduktion Technik basiert auf der MARCM System ¹⁰ auf und nutzt die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen Ras ^V12 und der Verlust der Zellpolarität Gene (gekritzelt, Scheiben großen und tödlichen Riesen Larven) zu invasiven Tumoren ⁹ generieren. Ich zeigen, wie diese Tumoren können in der intakten Larven visualisiert unddann, wie diese können zur weiteren Analyse seziert werden. Die vereinfachte Protokoll hier vorge sollte es möglich machen, damit diese Technik durch Forscher interessiert Verständnis der Rolle von einem Gen in Tumorinvasion verwendet werden.

Introduction

Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein schrittweise Prozess, der durch Hinterziehung von in den Körper ⁸ vorhandenen Schutzmechanismen gekennzeichnet ist. Zum Beispiel Tumorzellen im Körper muss in der Lage, Apoptose und das Immunsystem zu entgehen, Durchbruch des Fachextrazellulären Matrix (ECM) genannt Basalmembran und der Bewältigung der sozialen Kontrolle durch die umgebenden Zellen ⁸ unterliegen. Es ist durch eine schrittweise Fortschreiten, dass die Krebszellen die Fähigkeit erwerben, entfernten Stellen in einem Prozess namens Metastasen wandern und zu kolonisieren. Unser Verständnis von, wie die Tumorzellen, die Barrieren durch den Körper auferlegt windet ist immer noch in den Kinderschuhen, aber die Schwellen Bild von der Forschung bisher getan verweist auf eine wiederholte Verwendung von normalen Entwicklungsprozesse und Signalwege von den Krebszellen ^11-13.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist enorm, unsere und trugerstanding der normalen Entwicklung und Krankheit durch den Einsatz von hoch entwickelten genetischen Techniken in den vergangenen Jahrzehnten ^{14 bis 17} entwickelt. Mutagenese und Überexpression Instrumente haben wir auf ein besseres Verständnis der verschiedenen Onkogene und Tumorsuppressorgene ^18-22 angekommen. , Tumormetastase ist jedoch ein Ergebnis der Zusammenarbeit mehrerer genetischer Läsionen, die hauptsächlich in Zellkulturmodellen ^23,24 sowie verschiedene Xenograft-Modellen ^25-27 untersucht worden. Diese Modelle aber leistungsstarke haben ihre Grenzen, da sie nicht gänzlich nachvollziehen dürfen die in einem lebenden Organismus gefunden. Außerdem transgenen Modelle in Mäusen sind umständlich und nicht förderlich für die genetische Analyse von invasiven Verhalten ^28,29. Mehrere Studien haben versucht, die Invasion von Tumorzellen in Drosophila ^30,31 verstehen. Diese Techniken nutzen, vor allem die Transplantation von Primärtumoren, um Hosts und dann auf die Verfolgung der tra verlassennsplanted Tumoren für die Invasion von Nachbargeweben ^32,33. Eine leistungsstarke Technik namens MARCM ¹⁰ wurde durch Pagliarini und Xu angepasst, um Tumorinvasion in Drosophila ⁹ modellieren. Dieses elegante genetischen Modellierung der Tumorinvasion nutzte die Zusammenarbeit zwischen einem aktivierten Onkogen und dem Verlust der Zellpolarität. Die Kraft dieser Modellierung besteht darin, dass die invasive Tumoren im intakten Organismus damit umgehen die Notwendigkeit für die Transplantation von Geweben geschaffen. Über die Zusammenarbeit onkogenen bringen, eine aktivierte Onkogen wie Ras ^V12 in Klonen von Zellen in der larvalen Augenantennenscheibe ausgedrückt. Als Ergebnis der MARCM Technik diese Klone auch mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) zur einfachen Visualisierung markiert und homozygot für Zellpolarität wie letalen Mutanten Riesenlarven, scribbled und Scheiben groß gemacht. Das Ergebnis ist GFP markiert invasiven Tumoren in der Kopf komplex. In diesem Bericht, den ichzeigen, wie man zu induzieren, und visualisieren diese invasiven Tumoren sowohl im Kontext eines intakten Larven und in herauspräpariert Kopf komplex. Die hier präsentierten Tumorinduktion verwendet Reagenzien auf dem zweiten Chromosom von Drosophila. In Tabelle 2 I liefert eine Auflistung von Aktien, die an X und ^3. Chromosomen, die für den gleichen Zweck verwendet werden können. Ich glaube, dass diese vereinfachte Protokoll wird diese Technik leicht zugänglich für Forscher, die sich für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Tumorprogression zu machen.

Protocol

1. Induktion von Gutartige Nicht-invasive Tumoren Verwenden Bestände in Tabelle 2 aufgelistet für die Induktion von gutartigen Tumoren. Bereiten Sie eine Starterkultur für die "Tester" Lager der folgenden Genotyp: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP Bereiten Sie eine Starterkultur für die "getestet" Lager der folgenden Genotyp: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / Cyo Sammeln…

Representative Results

Als ein Ergebnis der hier vorgestellten Protokoll der Benutzer in der Lage, gutartigen Tumoren durch Überexpression eines aktivierten Onkogens im Larven Auge Antennen Imaginalscheibe induzieren. Der Benutzer wird auch in der Lage, invasiven Tumoren am Auge Antennenscheibe durch Überexpression eines aktivierten Onkogens in Klonen von Zellen induzieren auch eine Zellpolarität Gen-Mutante. Die Tumoren können leicht mit Hilfe eines Stereomikroskops, wie fluoreszierende "green fluorescent" Gewebe im ganzen Larv…

Discussion

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die mit heute ein viel besseres Verständnis als in der Vergangenheit. Allerdings bleibt noch viel zu lernen und erklärt, bevor wir ein vollständiges Bild der zugrunde liegenden Mechanismen werden. Die hier vorgestellten einfaches Protokoll ist es möglich, genetisch induzieren benigne und invasiven Tumoren in einem ganzen Organismus zu untersuchen und dann die Biologie mit der Progression von Tumoren in diesem Modell zugeordnet sind. Die meisten der bestehenden Techniken in Dro…

Materials

10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution	Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution	Invitrogen, Sigma Aldrich		Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap	Carolina Biologicals		Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative	0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde		Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket	Several		Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube	Various
Glass slides, cover glass	Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media	Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil	Polysciences Inc. or Halocarbon.com		Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish	Can be found at any general merchandise store		Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope	Leica and others		Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish	Sigma Aldrich
Paint Brush	Can be found at any general merchandise store
			Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.