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Bioengineering

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Published: October 21, 2013 doi: 10.3791/50771
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California at Riverside

Summary

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Abstract

Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos in vitro para el estudio de microvasos porque en estudios con animales in vivo son más que consume tiempo, es caro, y la observación y cuantificación son muy desafiante. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro tienen limitaciones cuando se representa en microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y proporcionar flujo de fluido continuo. Usando una combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos, hemos desarrollado un multi-profundidad endotelializadas transversales circulares microcanales-on-a-chip, que imita a la geometría 3D en vivo microvasos y se ejecuta bajo perfusión continua controlada flujo. Un fotoprotector reflowable positivo se utilizó para fabricar un molde principal con una red de microcanales de sección transversal semicircular. Por la alineación y unión de los dos (PDMS) microcanales polidimetilsiloxano replicated del molde maestro, se creó una red de microcanales cilíndrica. Los diámetros de los microcanales pueden ser bien controlados. Además, las células primarias endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) sembradas dentro del chip mostraron que las células se alineaban en la superficie interior de los microcanales de acuerdo con la perfusión controlada duradera para un período de tiempo entre 4 días a 2 semanas.

Introduction

Los microvasos, como una parte del sistema de circulación, median las interacciones entre la sangre y los tejidos, apoyar las actividades metabólicas, definir microambiente del tejido, y desempeñan un papel crítico en muchas condiciones patológicas y de salud. Recapitulación de microvasos funcionales in vitro podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejas. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro, tales como ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de formación de tubos endoteliales, y ensayos de anillos aórticos de rata y de ratón, no son capaces de recrear la microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y de control de flujo continuo 1-8. Estudios de microvasos utilizando modelos animales y en ensayos in vivo, tales como ensayo de angiogénesis corneal, ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoidea de pollo, y el ensayo de tapón de Matrigel, son más tiempo, alta en costo, desafiando con respecto a la observación y cuantificaciones, yplantear cuestiones éticas 1, 9-13.

Los avances en la microfabricación y tecnologías de chips de microfluidos han permitido una gran variedad de conocimientos sobre ciencias biomédicas, mientras reduciendo el alto costo y la complejidad asociados con los animales de experimentación y en estudios in vivo 14, como las condiciones biológicas controladas fácilmente y firmemente y entornos fluidos dinámicos, que no tendrían sido posible con las técnicas convencionales macroescala.

A continuación, presentamos un método para construir un endotelizado microcanales-on-a-chip que imita la geometría 3D de in vivo microvasos y se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada mediante el uso de la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos.

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Protocol

1. La fotolitografía Fabricación de Fotoresinas Molde Maestro

El siguiente protocolo muestra el proceso para la fabricación de los microcanales con diámetros entre 30-60 micras. Para obtener un microcanal con un diámetro más pequeño (menos de 30 micras), un solo giro de recubrimiento de resina fotosensible se necesita.

  1. Transferir la resina fotosensible reflujo de la nevera a 4 ° C para la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente.
  2. Limpiar una oblea de silicio y hornear durante una hora a 150 ° C para permitir que se deshidrate. La deshidratación se ayudar a la adhesión a la resina fotosensible sustrato de silicio.
  3. Spin-capa de la primera capa de resina fotosensible usando la siguiente receta:
Paso Tiempo (segundos) Velocidad (rpm) Aceleración
1 2 </ Td> 300 alto
2 10 0
3 3 300 alto
4 60 600 alto
5 10 500 alto
6 10 600 alto
  1. A continuación, cocer la oblea en una placa calefactora con una temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Después de la cocción suave el espesor de la resina fotosensible será 20-30 micras.
  2. Girar capa una segunda capa de resina fotosensible siguiendo la misma receta utilizada para la primera capa.
  3. Hornear suave de la oblea de nuevo colocándolo en una placa caliente con una temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Después de esto hornear suave el espesor de la resina fotosensible será 40-60 micras.
  4. Generar patrones maestros positivos mediante la exposición de la photorESIST a la luz ultravioleta con una dosis de exposición de 14.500 mJ / cm 2 a través de una máscara de la película.
  5. Diluir el desarrollador con agua desionizada (DI) agua (1:2 (v / v)). Enjuague la oblea repetidamente en la solución hasta que el patrón está completamente desarrollado. Luego lave la oblea con agua desionizada y séquelo con gas nitrógeno.
  6. Reflujo: Lugar de la oblea en una placa caliente con una temperatura de 120 ° C durante 4 min y cubierta con una placa de Petri de vidrio para evitar la evaporación del disolvente. Retire la oblea de la placa de cocción y deje que se enfríe a temperatura ambiente. El espesor de la resina fotosensible después del reflujo, será de 50-60 micras.

2. Fabricación litografía blanda de red de microcanales PDMS

  1. Preparar la solución de polidimetilsiloxano (PDMS) en la relación en peso de 10:01 (base: agente de curado) y se mezcla a fondo usando un mezclador planetario centrífuga.
  2. Echad la solución de PDMS sobre la reflowed molde matriz fotosensible. Coloque el PDMS fundido en un desecador durante 15 minutos para desgasificar. Utilice gas nitrógeno para eliminar cualquier burbuja restantes si es necesario.
  3. Hornear el PDMS en un horno a una temperatura de 60 ° C durante 3 horas para permitir que se cure. A continuación, retire la capa de PDMS curado del molde maestro.
  4. Use un punzón afilado para crear orificios de entrada / salida haciendo agujeros en la red de canales. Limpiar la superficie de la PDMS utilizando gas nitrógeno.
  5. Tratar dos capas de PDMS con plasma de oxígeno durante 30 segundos en el interior de un limpiador de plasma a una presión de funcionamiento de 4,5 x 10 -2 Torr y una tasa de flujo de oxígeno de 3,5 m 3 / min. A continuación, alinee las superficies de la PDMS manualmente bajo un microscopio óptico. Utilice una gota de agua si es necesario para un mejor control de la alineación.
  6. Hornear el dispositivo en un horno a 60 ° C durante 30 minutos para conseguir una unión permanente.

3. Cultura HUVEC y siembra en el chip

  1. Cultura las HUVEC con medio de cultivo con L-glutamina suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Para thSe han usado pasajes experimento E entre 2 y 5.
  2. Una vez que las HUVEC son confluentes, contar las células y la cosecha de ellos por primera enjuagar las células con solución salina tamponada con HEPES (HEPES-BSS), y a continuación, tratar las células con tripsina / EDTA y se incuba durante 2-6 min a 37 ° C. Después de la tripsinización es completa, neutralizar la tripsina / EDTA con tripsina solución neutralizante. Centrifugar y suspender las células en medio de cultivo con 8% de dextrano para recogerlos. El dextrano se utiliza para aumentar la viscosidad media para ayudar en la siembra de células y una mejor unión.
  3. Se trata el dispositivo con plasma de oxígeno durante 5 min con una presión de funcionamiento de 4,5 x 10 -2 Torr y una tasa de flujo de oxígeno de 3,5 m 3 / min. A continuación, cargue el dispositivo con agua DI y tratamiento con luz UV durante 8 horas en una campana de bioseguridad laminar para la esterilización.
  4. Un día antes de que las células están listas, lave el aparato con 1x tampón fosfato salino (PBS 1x) después cubra con fibronectina (100 mg / ml, dilbuido con 1x PBS) y se incuba en el refrigerador a 4 ° C durante la noche.
  5. Después de que el revestimiento de la fibronectina, lave el aparato con 1x PBS y luego cargar con medio de cultivo. Incubar el dispositivo a una temperatura de 37 ° C durante 15 min.
  6. Cargar las células HUVEC en medio de cultivo 8% de dextrano con una concentración de células de 3-4 x 10 6 células / ml. Coloque una gota de 20 l de células a una entrada del dispositivo y la inclinación de introducir las células en el canal microfluídico. Después de 15-20 min las células comienzan a adherirse a las paredes laterales de los canales. Girar el dispositivo cada 15 minutos para crear una distribución más uniforme de las células. Si es necesario, la carga adicional se puede realizar.

4. Configuración de perfusión a largo plazo

Después de 5-6 horas de cultivo estático, las HUVECs adjuntos comenzarán a extenderse plenamente. Configure la perfusión con un sistema de bomba de jeringa con mando a distancia, con un flujo constante de 10 l / h. La perfusión se puede ajustar fo un caudal mayor, y pueden durar un período de tiempo entre los 4 días a 2 semanas.

5. Tinción de células y caracterización Microscopio

  1. Cuando las células alcanzan la confluencia en el interior del dispositivo, en primer lugar, lávese el dispositivo con 1x PBS para eliminar completamente el medio. A continuación, cargar el dispositivo con colorante rojo diluido con diluyente (4 l-1 ml). Cargar el medio de contraste similar al procedimiento de carga de las células. Incubar el dispositivo en la oscuridad durante 5 min a temperatura ambiente, y luego lavar el dispositivo con medio de cultivo para detener la tinción. Largo de incubación del medio de contraste puede causar toxicidad celular y disadhesion.
  2. Cargar el dispositivo con colorante azul diluido en PBS 1x (2 gotas por ml). Incubar en la oscuridad durante 5 min a temperatura ambiente, luego lavar bien el dispositivo con 1x PBS.
  3. Examinar la tinción de las células bajo un microscopio óptico invertido. Si la tinción era bueno, cargue los microcanales con un medio de fijación (3,5% de paraformaldehído diluido con 1x PBS), a continuación, sumerjael dispositivo de fijación de medio y cubrir completamente con papel de aluminio. Guarde el dispositivo en el refrigerador a una temperatura de 4 ° C para evitar que el dispositivo se seque y photobleaching. El dispositivo fijo está ahora listo para la formación de imágenes confocal, que puede ser realizado por un microscopio confocal de barrido láser.

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Representative Results

Nuestro enfoque para la fabricación de la red de microcanales de múltiples profundidad imita las complejas geometrías 3D de microvasos in vivo, en el que los microcanales han redondeado las secciones transversales 15. Además, los diámetros de los canales de ramificación matrices y los canales de memoria de aproximadamente obedecen la ley de Murray para mantener el flujo de fluido a un nivel requerido para que la resistencia total del canal es baja y velocidades de flujo son más uniforme en toda la red 16-18. Los procesos y los resultados para la fabricación de un molde maestro fotorresistente semicircular y una red de microcanales de PDMS de sección transversal circular se demostraron en la película 1, Figura 2, y de la película 2, respectivamente. Las características geométricas de la red de microcanales PDMS se caracterizaron y se muestran en la Figura 2. Nuestros resultados muestran que la técnica de reflujo de resina fotosensible puede crear redes de canales de ramificación de múltiples profundidad ina enfoque más conveniente mediante técnicas de reflujo fotosensible, y permitir que el diseño de los sistemas biomiméticos microvasculares cuales aproximadamente obedecen la ley de Murray.

En muchos modelos in vitro, las células vasculares normalmente se cultivaron en placas planas, filtros, o estos sustratos revestidos con hidrogeles. Bajo estas condiciones, los microvasos son generados aleatoriamente por celular autoensamblaje. Además, los ensayos convencionales tienen dificultades inherentes en la consecución de un flujo constante en las células endoteliales. La falta de un largo plazo y continuo flujo de los medios de comunicación evita la capacidad de mantener la estabilidad de la monocapa de células endoteliales con funciones de barrera apropiados. En nuestro modelo, el beneficio de microfluidos que aplican es la comodidad para el acceso y control de fluidos (caudales variables, la duración y los patrones), así como la eliminación de residuos. Nos demuestran los procesos de las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC primarios) de siembra en los microcanales y establecer lleven un sistema de perfusión de fluido a largo plazo para el cultivo celular (Figura 3). Por otra parte, debido a las complejas geometrías de in vivo microvasculatura, la monitorización en tiempo real de los vasos pequeños es difícil. El chip basado en PDMS desarrollado ofrece buenas propiedades ópticas y permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real de los microcanales endotelializadas. (Figuras 4 y Movie 3)

Movie 1. Los procedimientos de fabricación esquemáticos para moldes maestros fotorresistentes. Inicialmente, se preparó un sustrato de silicio pre-limpieza. La capa de resina fotosensible positiva reflujo se aplicó por rotación se revistió sobre el sustrato de silicio y se coció y se secó. La resina fotosensible se expone a la luz UV a través de una máscara de modelado y, a continuación, se han desarrollado los microcanales estampadas. Una red de microcanales de sección transversal semicircular, fue creado después de que el reflujo a 120 ° C durante 4 min."target =" _blank movie1.wmv "> Haga clic aquí para ver la película.

Figura 1
Figura 1. SEM muestra la fotoprotección desarrollado una) antes de reflujo;. B) después del reflujo, c) moldeado PDMS muestra la sección transversal de la capa protectora antes de reflujo, la imagen muestra una sección transversal rectangular; d) moldeado PDMS que muestra una sección transversal semicircular de la resistir después de reflujo; La sección transversal después del reflujo fue controlada por el diseño de dimensión inicial del patrón y la temperatura de reflujo. (Reproducido con permiso de la referencia 15). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Película 2. Los procedimientos de fabricación esquemáticas para red de microcanales cilíndrica en PDMS. Una solución de PDMS se coló sobre el molde de resina fotosensible y se cura en el horno a una temperatura de 60 ° C durante 3 horas. Dos capas de PDMS curados idénticas, cada una de las cuales tiene una red de microcanales sección transversal semicircular, fueron alineados y unidos entre sí para formar micro-canales con sección circular. Haz clic aquí para ver la película .

La figura 2
Figura 2. a) Una red de microcanales cilíndrica alineados y unidos en PDMS. bd) de sección circular de los moldes de PDMS muestran las dimensiones del canal en cada nivel de ramificación (1-1 ', 2-2' y 3-3 '). Además, estas figuras muestran la creación de un multibranching y la red de canales de microfluidos multidepth circular en sección transversal.

page = "always"> Figura 3
Figura 3. Diagrama esquemático que muestra el largo plazo de perfusión a través del chip utilizando una bomba de jeringa controlada a distancia.

Figura 4
La Figura 4. Imágenes de microscopía utilizando membrana de la célula colorante fluorescente (rojo) y (azul) muestran colorante nuclear de células HUVEC que la línea de la superficie interna de una red de microcanales cilíndrica en diferentes regiones de ramificación. A) superior, b) Medio, y c) inferior. D) Imagen de microscopía confocal muestra la vista de sección transversal circular de HUVECs que recubren la red de canales. Las barras de escala: 100 micras.

Película 3. Confocal que muestra la película de revestimiento de las células a lo largo de la red de canal circular."target =" _blank iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"> Haga clic aquí para ver la película.

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Discussion

1. Fabricación del molde maestro

Uno de los principios rectores para el diseño y la morfometría vascular se conoce como la ley de Murray 16, que establece que la distribución de los diámetros de los vasos a lo largo de la red se rige por consideraciones de energía mínimo. También establece que el cubo de los diámetros de un vaso principal en una bifurcación es igual a la suma de los cubos de los diámetros de los vasos hija ( Ecuación 1 ) 19 Además, la ley de Poiseuille se ha utilizado para estimar la magnitud de la tensión de cizallamiento en la mayor parte de la vasculatura como se Ecuación 2 . en el que1eq3.jpg "src =" files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" / 25px "/> es la tensión de cizallamiento hemodinámica, μ es la viscosidad de la sangre, Q es el caudal, y R es el radio de la buque 20,21. Para bifurcaciones simétricas, una consecuencia importante sobre la base de la ley de Murray y la ley de Poiseuille es que la tensión de cizallamiento se mantiene constante a lo largo de la red vascular. Así, para una red de canales de microfluidos simétrica fabricado con secciones transversales circulares, si el canal dimensiones a la ley de bifurcaciones obedecer Murray, el esfuerzo cortante experimentada por las células endoteliales deben ser constantes en los diferentes canales de ramificación.

Muchas de las técnicas y procesos de microfabricación se han aplicado a la fabricación de micro-canales utilizados para las células vasculares 22-25, sin embargo, los microcanales resultantes resultaron en secciones transversales rectangulares, cuadrados o trapezoidal de canales. Las secciones transversales rectangulares de canales están contruido con esquinas agudas y transiciones abruptas en las bifurcaciones, que puede imponer ampliamente variables tensiones de cizallamiento del fluido y geometrías no fisiológicas en las células en diferentes posiciones de los canales, lo que resulta en variaciones en la fisiología celular 26,27.

Un proceso de reflujo fotorresistente, lo que resulta en un perfil de canal redondeada, implica dos procedimientos, 1) el punto de fusión de la resina fotosensible modelado y resistir el líquido superficies son introducidos en una forma que minimiza la energía del sistema de 28,29 y 2) un enfriamiento y fase de solidificación sigue el proceso de fusión. Las formas de los canales reorganizados son bien aproximarse por una superficie semicilíndrica. Seguido por refluido maestro fabricación del molde, se utilizó un enfoque estándar de litografía blanda para fabricar la red de microfluidos PDMS canal con una sección transversal circular. Nuestros resultados muestran que la técnica de reflujo de resina fotosensible puede crear redes de microcanales de ramificación de múltiples en una profundidad más straight enfoque hacia adelante, y nos permite diseñar sistemas biomiméticos microvasculares que aproximadamente el obedecer la ley de Murray e imitan la geometría en vivo microvasculatura, de modo que la resistencia total del canal es baja y las variaciones de tensión de corte en diferentes niveles de ramificación puede ser minimizado en la fabrica red de canales de microfluidos.

Los microvasos sanguíneos fisiológicos adoptar una sección transversal más o menos circular con radios de entre 30-300 micras 30. Las dimensiones de la red de microcanales se demuestra en este trabajo fueron variadas en torno a 60 micras a 100 micras, con diferentes niveles de ramificación. Para fabricar micro-canales con diferente gama de diámetros para imitar in vivo microvasos, recomendamos utilizar reflujo capa hilada sola resistir (limitado a 30 micras) o de otro menor viscosidad resiste. Para un microcanal con un diámetro mayor (30-60 micras), un procedimiento de doble recubrimiento se puede aplicar para obtener una película fotorresistente gruesa15. Adicional spin-revestimientos por encima de dos capas debe evitarse para prevenir espesor de la película no uniforme, lo cual puede resultar en una dosis de exposición inexacta. Para un espesor superior a 60 micras, se recomiendan otras resinas fotosensibles reflujo viscosos superiores.

En una condición ideal, para la fabricación de un molde de resistir con una sección transversal semicircular, el espesor de la película puede ser inicialmente predeterminada por dando un ancho requerido y la distancia focal del microcanal como Ecuación 4 , Donde H es el espesor de película requerido hilado-, r es la mitad de la anchura del canal, R es el radio de curvatura constante, h es la altura central de la curvatura, y E es la relación de volúmenes de resistir el microcanal antes y después de reflujo 31. Para una superficie cilíndrica de una anchura dada de microcanal, un volumen particular de la resistencia es rerequerida. Sin embargo, se han reportado varios parámetros para afectar a la fotoprotección refluido y hacer que los perfiles de canal dado como resultado más compleja, tales como ángulo crítico y el movimiento límite entre la resina fotosensible y el sustrato sólido, la evaporación del material de reflujo durante la cocción, la temperatura y el tiempo para el proceso de reflujo, desgasificación, la uniformidad sustrato, y resistir propiedades 32-34. Por ejemplo, la temperatura de reflujo y el tiempo pueden resultar en un cambio de volumen provocando el movimiento límite y por lo tanto variando el ángulo crítico y última reflowed resistir el perfil 33. Según lo informado por nuestro trabajo anterior 15, el proceso de reflujo disminuye el ancho de canal en un 2%, en promedio, debido a la reducción del volumen y el movimiento fotosensible límite. Además, el volumen para obtener una superficie cilíndrica necesita para tener en cuenta el efecto de la evaporación del material durante el proceso de reflujo 35,36. Si se requieren superficies cilíndricas con diferentes radios a travésuna red de microcanales es necesario variar la anchura de los microcanales, lo que resulta en variaciones en los volúmenes en diferentes regiones de la red 15. Para fabricar con éxito una red de canales cilíndricos con diferentes diámetros, la resiste anchos / volúmenes, temperaturas y tiempos de reflujo, ángulos críticos, movimientos límites, resistir viscosidades y protocolos de recubrimiento por rotación, y las propiedades del sustrato debe ser considerado y probado.

2. Cultivo celular a largo plazo

La importancia del flujo y de la tensión de cizallamiento asociado ha sido bien reconocido en la regulación de la biología endotelial. Esto se ha visto en áreas tales como la inducción de cambios en la forma celular y la orientación, la secreción y la organización, la proliferación y la diferenciación, señalización intracelular, la producción de proteínas del citoesqueleto y la expresión génica, maduración de los vasos y la estructura y funciones de barrera 37-47. La corriente en métodos in vitro para la formación de finaltubos othelial generalmente se basan en células endoteliales '(EC) auto-organización con o sin células mesenquimales en la matriz extracelular (ECM) (colágeno tipo I, fibrina, o Matrigel) 48-54. A pesar de estas culturas han modelado con éxito varios comportamientos microvasculares, los vasos artificiales formados a través de un proceso aleatorio de la morfogénesis carecen de la reproducibilidad y la orientación espacial deseada. Además, el impacto del flujo sobre la estabilidad microvascular sigue siendo en gran medida desconocido debido a que estos vasos auto-ensambladas no se combinan fácilmente el flujo luminal con una organización tubular de 3D ​​55, que presenta un desafío a los vasos sanguíneos de ingeniería para tener las funciones de barrera y la estabilidad vascular a largo plazo.

Sistemas microfluídicos han demostrado ser práctico y útil para la introducción de los flujos de a una variedad de análisis bioquímicos y biológicos 56,57. Nuestro enfoque proporciona una manera conveniente de introducir el flujo de fluido sobre las células cultivadas. Hemos utilizado unbomba de jeringa controlada a distancia avanzado para lograr un control de flujo conveniente pero constante y precisa a través de los microcanales para el cultivo celular a largo plazo (entre 4 días y 2 semanas).

3. Cultivo de células en el chip

Oxidación asistida por plasma de los microcanales de PDMS que introduce los grupos silanol (SiOH) en las superficies que hace que la superficie hidrófila y ayuda en recubrimientos adicionales de proteínas. Diferentes proteínas de la MEC (fibronectina, gelatina y colágeno) se ensayaron para determinar la unión de células, y se encontró que el mejor resultado para ser recubrimiento fibronectina. Las HUVEC se prepararon a una concentración de 3 x 10 6 células / ml en medio de cultivo suplementado con 8% de dextrano (70 kDa) para la siembra. Dextrano aumenta la viscosidad de los medios de comunicación para permitir el control fino sobre densidad de siembra de ECs.

A monocapas se desarrolló entre los 2-4 días de los HUVECs siendo expuestos a un flujo medio constante. Para visualizar las células después de lacultivo celular, que etiqueta las células con tinción de la membrana y los tintes de tinción núcleos, estos colorantes exhiben citotoxicidad inferior 58. Estamos manchados las células como una monocapa adherente cultivadas en el chip. Un completo lavado con PBS 1x es necesario para evitar colorantes adicionales atrapadas en el interior del chip.

En resumen, por la combinación de reflujo técnica de resina fotosensible y la replicación de PDMS, la red de microcanales de múltiples profundidad desarrollada se aproxima por una superficie circular y los diámetros del canal en cada bifurcación aproximadamente obedecen la ley de Murray. Las variaciones de tensión de corte en diferentes niveles de ramificación puede ser minimizado en la red de canales de microfluidos fabricado. Además, los resultados de cultivo de células indicaron la condición saludable de las células endoteliales. Por lo tanto, los microcanales-en-un-chip endotelializadas desarrollados proporciona un enfoque rápido y reproducible para crear redes de microcanales multidepth circular en sección transversal de múltiples ramificación y, que imita lageometría en vivo microvasos. El procedimiento se ilustra el uso de las capacidades únicas de microfabricación avanzada y tecnologías de microfluidos para crear un modelo microvasculatura con un control de la perfusión continua a largo plazo, así como de alta calidad y en tiempo real, capacidad de imagen. Con la creciente utilidad de canales de microfluidos para la biología celular, ingeniería de tejidos, y aplicaciones de bioingeniería, los microcanales-en-un-chip endotelializadas es un ensayo de potencial para la investigación microvascular.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Esta investigación fue parcialmente apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (NSF 1227359), WVU programa EPSCoR financiado por la National Science Foundation (EPS-1003907), oficina WVU ADVANCE patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencia (1.007.978), y WVU PSCoR, respectivamente. El trabajo se realizó en microfabricación WVU compartido investigación (instalaciones para salas blancas) y Microfluidic Investigación Celular Integral de Laboratorio Chip (microchip Lab) de la Universidad de West Virginia. La imagen confocal se realizó en WVU Fondo de imágenes del microscopio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

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